基因的克隆、表达载体构建及功能验证分析.docVIP

基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 基因克隆 事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎ 实验前准备工作 设计引物，准备材料， 购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试剂盒 实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准备 ※ 基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化— 涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 总RNA的提取纯化Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好纯度高，以利于下一步的实验。 实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制 75%200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均。 Trizol 法总RNA实验步骤如下： （1）1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，，15 s，15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜多糖高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）上清液0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。 （4）在12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 7）1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解（9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。 （11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取μl无RNase的水溶解RNA。 RNA的质量及纯度检测 取2ul RNA 与1 ul ×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% RNA 条带并记录实验结果。 分光光度计RNA纯度检测 取ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质量。 cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 在Eppendorf管中配制下列混合液：试剂名称 使用量 模板RNA 1 μg Oligo dT primer (50 μM) 1 μl dNTP Mixture(10 mM) 1 μl RNase free dH2O up to 10 μl 2） 65 ℃保温15 min 后迅速在冰上急冷2 min。 3） 离心数秒使模板RNA/引物等的混合液聚集Eppendorf管底部。 4） 在上述Eppendorf管中配制下列反转录反应液: 试剂名称 使用量 上述模板RNA/引物等的混合液 10 μl 5×Frist-Stand Buffer 4 μl RNase Inhibitor(40 U/ μl) 0.5 μl MTV RTase (10 U/μl) 0.5 μl RNase free dH2O up to 20 μl 5） ℃保温60 min。