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SMARTer™ RACE cDNA 扩增试剂盒实验流程 SMARTer™ RACE cDNA 扩增试剂盒 操作一览 (PT4096-2) 本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMARTer RACE cDNA 扩增试剂盒 (Cat. Nos. 634923 634924) 的说明书。 一、RACE-Ready cDNA 的准备 为了获得RACE-Ready cDNA (说明书的Section V) ，请准备5’- 3’-RACE-Ready cDNA 合成 反应体系，共需要4 个反应管，每管均为10µl 反应体系。 1. 混匀以下试剂，并瞬时离心。在进行 Step 7 前，将反应管室温放置: 2.0 µl 5X First-Strand Buffer 1.0 µl DTT (20 mM) 1.0 µl dNTP Mix (10 mM) 4.0 µl 总体积 2. 分别向这些管中加入对应的以下试剂： 准备5-RACE-Ready cDNA 准备3-RACE-Ready cDNA 1.0–2.75 µl RNA* 1.0–3.75 µl RNA* 1.0 µl 5-CDS Primer A 1.0 µl 3-CDS Primer A *使用1 µl 对照小鼠心脏总RNA(1 µg/µl) 。 3. 将step2 中的5-RACE-Ready cDNA 定容至3.75 µl ；将3-RACE-Ready cDNA 定容至4.75µl。 4. 混匀试剂，瞬时离心。 5. 72°C 孵育3 min，然后42°C 冷却2 min 。最后14,000rpm 离心10sec。 注意: 此步骤在PCR 仪中进行，在孵育时，准备step7 。 6. 向5’RACE 反应管中各加入1 µl SMARTer IIA oligo ，混匀后瞬时离心。 7. 室温下，按顺序混匀以下试剂： 4.0 µl Buffer Mix （Step 1 ） 0.25 µl RNase Inhibitor (40 U/µl) 1.0 µl SMARTScribe™ Reverse Transcriptase (100 U) 5.25 µl 总体积 8. 将分别向Step 5 和step6 中变性的RNA 反应物管中加入Step7 中的5.25 µl 混合物，每管 体积均为10 µl。 9. 使用枪轻柔地混匀试剂，瞬时离心。 10. 42°C 孵育90 min 。 11. 70°C 加热10 min 终止反应。 12. 用TE 缓冲液稀释第一链反应产物： • Add 20 µl if you started with 200 ng of total RNA. • Add 100 µl if you started with 200 ng of total RNA. • Add 250 µl if you started with poly A + RNA. 13. 反应产物–20°C 可保存最多3 个月。 二、快速扩增cDNA 末端(RACE) 阳性对照RACE PCR 实验(说明书的Section VI.B) 快速扩增cDNA 末端(RACE) (说明书的Section VI.D) 基因特异性引物(GSPs)： 1 SMARTer™ RACE cDNA 扩增试剂盒实验流程 • 23–28 nt • 50–70% GC • Tm ≥65°C；最好使用Tm 7