2013年现代医学实验仪器与实验技术复习题.ppt

7 Western Blotting检测目标蛋白质的原理 Western Blotting是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白质的定性、定量方法。该方法需要将组织或细胞裂解后使释放出来的蛋白质通过SDS电泳进行分离，然后将凝胶中分离开的蛋白质平行转印到NC或PVDF膜等固相载体上再与相应的特异抗体发生免疫反应。可用来确定同一蛋白质在不同细胞或同一细胞在不同条件下的相对含量。由于其检测往往需要抗体与转印到膜上的特定的目的蛋白相结合，所以被称为免疫印迹技术 8 简述Sanger双脱氧链终止法DNA测序的原理 在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP),由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列 9 如何对测序报告进行简单解读及对核苷酸序列进行初步的分析 1）删除载体及附加序列 2）寻找基因 根据开放读码框利用软件预测或确定基因的起始密码子、信号肽、终止密码子及3’端的确认、非编码序列、内含子、密码子偏爱性、外显子－内含子边界、上游控制顺序等确定转录起始位点区，即mRNA的5’端 3）利用生物信息学及相关软件和互联网查询或比较其同源性 4）确定DNA顺序中基因的位置及其在基因组中的功能 10 什么是激光共聚焦显微镜？有何主要用途？ 定义：利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器 主要用途：在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛应用 11 简述电镜样品取材时的注意事项，常规使用的固定剂是什么？浓度是多少？ 任何组织包括活检组织或培养细胞，取材时应注意： （1）快 在动物停止心跳后半分钟到二分钟内取材完毕，若为活检取材，也应尽速取下材料，将取出的材料立即浸入2.5%-3%戊二醛固定液中，取材时间最长不应超过10分钟。 （2）小 由于电镜所用固定剂穿透力很弱，因此取出的组织大小应在0.5-1mm之内，一般不允许大于1mm3 （3）准 由于电镜观察范围的局限性，在透射电镜样品取材时准确是最为重要的 （4）低温操作 生物样品取材时一般要求在4℃左右的低温下操作 （5）避免损伤 常规透射样品、扫描样品多采用用1/15M 或0.1M PBS液配置的2.5%-3%的戊二醛固定液 12 常见的电子显微镜种类及其特点？ 常见的电镜种类为透射电子显微镜、扫描电子显微镜及分析电子显微镜。 透射电子显微镜利用直接透射电子和部分弹性散射电子成像，观察生物样品细胞内部超微结构，所观察的样品为厚度100nm范围内的超薄切片； 扫描电子显微镜是利用样品本身所产生的二次电子成像，主要观察生物样品表面的立体形貌 分析电子显微镜是一种复合式电子显微镜，通常是在扫描电子显微或透射电子显微镜基础上外加辅助装置，如特征X线分析仪，俄歇电子分析仪，能谱仪等，这样在观察样品内部结构或样品表面立体形貌的同时又可对该样品所含元素成份进行分析 13 举例说明透射电镜在临床病理诊断的优缺点？如何弥补缺点？ 透射电镜优点是分辨能力高，可观察小于0.1um的细胞微细结构和各种特殊物质以及病原体 由于其所观察切片厚度为100nm范围，视野小，观察范围局限是其最大缺点 为了克服其缺点，通常采取三片会诊，即常规切片（光镜）、半薄切片、超薄切片（电镜）检查。总之电镜在临床病理诊断中必须以光镜为基础，结合半薄切片定位，才能最大性能的发挥其优势，避其缺点 14 何谓分子影像学？简述小动物光学活体成像技术的分类及各自的优点 概念：应用影像学方法，对活体状态下的生物过程进行细胞和分子水平的定性和定量研究 分类：小动物分子光学活体成像技术分为生物发光成像法和荧光成像法 优点： 生物发光：① 特异性强，无自发荧光；② 灵敏度高；③ 可检测的深度较深，适合深层成像；④ 发光稳定、定量精确 荧光发光：① 荧光染料、蛋白标记能力强、种类多；② 信号