消瘤汤干预大肠癌细胞凋亡相关基因bcl-2 bax表达实验探究.doc

消瘤汤干预大肠癌细胞凋亡相关基因bcl-2 bax表达实验探究(辽宁省肿瘤医院，辽宁沈阳110042) 摘要：目的：探讨消瘤汤促进大肠癌细胞株HT-29凋亡的作用机制。方法：采用MTT法测消瘤汤对大肠癌细胞株HT-29作用的有效剂量，运用流式细胞仪测定消瘤汤对人大肠癌细胞株HT-29凋亡相关基因bcl-2、bax表达的影响。结果：消瘤汤可促进大肠癌细胞株HT-29凋亡；能抑制凋亡相关基因bcl-2、bax的表达，但对凋亡抑制基因bcl-2的抑制更明显。结论：消瘤汤能促进肿瘤细胞凋亡，其作用机制可能是通过抑制凋亡相关基因表达实现的。 关键词：消瘤汤；大肠癌细胞株HT-29；细胞凋亡；基因表达 中图分类号：R285.5　文献标识码：A 文章编号：1673-7717(2007)05-1014-03 消瘤汤由人参、黄芪、刺五加、薏苡仁、白花蛇舌草、半枝莲、莪术等组成，具有抗肿瘤和免疫调节作用。临床上用于治疗原发性肝癌、肺癌、直肠癌、恶性淋巴瘤及妇科恶性肿瘤。为探讨消瘤汤促进大肠癌细胞株HT-29凋亡的作用机制，更好地指导临床用药，设计了本实验，以流式细胞仪检测消瘤汤对大肠癌细胞凋亡相关基因bcl-2、bax表达的影响。 1实验材料 人大肠癌细胞株HT-29购于中国医科大学细胞生物实验室，常规条件下培养。消瘤汤(人参、黄芪、刺五加、薏苡仁、白花蛇舌草、半枝莲、莪术等)购于辽宁省肿瘤医院。流式细胞仪系美国BD公司生产，酶标仪Sunrise系TECAN(瑞士)生产。 2实验方法 2.1消瘤汤方　人参、黄芪、刺五加、薏苡仁、白花蛇舌草、半枝莲、莪术等购于辽宁省肿瘤医院，按常规方法煎出的药液约300mL，将中药药液4℃静置24h，取上清，12000r/min4℃离心10min，用0.22μm滤器过滤，将滤液密封后4℃条件下保存备用。 2.2MTT药物敏感实验　将大肠癌细胞株HT-29细胞常规培养至指数增生期，制备成单细胞悬液后调整细胞浓度到4×104个/mL，按预定方案接种于96孔无菌培养板内，每孔加入单细胞悬液0.1mL。将培养板于37℃、5％CO2培养箱内培养约24h，细胞贴壁后，弃上清并加入配制好的含药培养基(1:100、1:80、1:60、1:40、1:30、1:25、1:20、1:15、1:10、1:5、1:1)，另设空白孔(只加培养基不加药物)，培养48h。培养终止前4h，每孔加10μLMTT(5mg/mL)，再培养4h后，弃上清液，加入DMS0200μL(0.5mg/mL)/孔，用微量振荡器摇振5～10min后上酶标仪检测。 2.3 Annexin V/PI双染法细胞凋亡检测　调整细胞浓度4×104个/mL，每培养瓶中加入5mL无药培养基，培养24h后，弃掉培养基，加入高、中、低剂量的含药培养基培养72h。将药物作用后的细胞先用胰酶消化，吹打均匀后，调整待测细胞的浓度为1×106个/mL；取1mL细胞，1000r/min,4℃离心10min，弃上清；加入1mL冷的PBS，轻轻震荡使细胞悬浮；1000r/min。4℃离心10min，弃上清；重复步骤3、4两次；将细胞重悬于200μL Binding Buffer；加入10μLAnnexin V-FITC，轻轻混匀，4℃反应30min。加入5μL PI后加入300μL Binding Buffer，混匀后立即上机检测。 2.4凋亡蛋白检测 ①调整细胞浓度5×105～1×106个/mL，加4％多聚甲醛50μL固定15min后，1200r/min、4℃离心10min，弃上清。②加入1mL冷PBS，轻轻吹打使细胞均匀后，加1％TritOnx-100的PBS50μL在4℃下作用5min。离心，方法同上，弃上清。③加入1mL冷PBS，轻轻吹打使细胞均匀后，加入一抗(1:100)100μL，37℃水浴振荡1.5h。④加入1mL冷PBS，轻轻吹打使细胞均匀后，离心，方法同上。重复1次。⑤加入二抗(1:50)100μL，37℃水浴避光振荡1.5h。⑥重复步骤4一次。⑦加入500μL冷的PBS，轻轻振荡使细胞混匀后，上流式细胞仪检测。 2.5统计学方法　original6.1、spss11.5。 3结果 3.1MIT检测结果 消瘤汤各浓度对人大肠癌细胞株HT-29的增殖均有显著的抑制作用，且呈良好的量效关系。original6.1软件计算可知药物对大肠癌细胞株HT-29的IC50为1:(18.633±0.525)。根据此结果设定高、中、低剂量分别为：(1:10)、(1:20)、(1:40)。 3.2 Annexin V/PI双染法细胞凋亡检测结果 消瘤汤具有促进大肠癌细胞株HT-29凋亡的作用，并随着剂量的增大，促