清营汤对热盛阴虚证心力衰竭大鼠心肌微结构心肌细胞因子影响实验探究.doc

清营汤对热盛阴虚证心力衰竭大鼠心肌微结构心肌细胞因子影响实验探究摘要：通过联用异丙肾上腺素和甲状腺素，分两步制备出大鼠热盛阴虚证心力衰竭模型，观察清营汤对热盛阴虚证心力衰竭大鼠心肌细胞因子、心肌病理微结构变化等方面的影响。实验结果显示：清营汤中、高剂量组具有较明显的改善热盛阴虚证心力衰竭大鼠心肌组织病理变化．以及降低大鼠心肌组织中TNF－αmRNA、IL－1βmRNA含量的作用，表明清营汤对热盛阴虚型心力衰竭有较明显的治疗作用。 关键词：热盛阴虚证；心力衰竭；清营汤；细胞因子；心肌病理 中图分类号：R285.5　文献标识码：A　文章编号：1673－7717(2007)09－1838－04 清营汤为笔者经过多年临床实践而选择的治疗因热盛阴虚而致充血性心力衰竭(简称心力衰竭)急性发作时的常用方剂。本实验在采用异丙肾上腺素(ISO)联合甲状腺素(TH)成功制备热盛阴虚型心力衰竭大鼠动物模型的基础上，以大鼠心肌组织病理、心肌组织TNF－αmRNA、IL－IβmRNA的水平含量等为指标，较为系统地观察了清营汤对热盛阴虚型心力衰竭的疗效，旨在探讨清营汤对热盛阴虚型心力衰竭大鼠的作用机制，为其进一步的临床应用提供有力的依据。 1 实验材料 1．1　实验动物　Wistar大鼠雄性(鼠龄12－14周龄)，108只，清洁级，体重(200±20)g。由浙江中医药大学动物中心提供并饲养。 1．2　实验药品　盐酸异丙肾上腺素(上海禾丰制药有限公司批号：3E20003)、甲状腺素片(浙江尖峰药业有限公司批号：040201)、RT-PCR反应试剂盒(日本Takara公司)、引物(由上海之江生工生物工程技术服务有限公司合成)。 1．3　实验器材　PCR仪(PE GeneAmp PCR system 2400，美国PE公司)、紫外分光光度计(HP 8453，德国HP公司)、荧光定量PCR仪(FTC 2000，加拿大枫岭公司)、基因扩增仪(Teehgene，英国TECHNE公司)、凝胶图象分析系统(BioSenSC300，上海山富科学仪器有限公司)。 1．4　清营汤药物组成与制备　清营汤由犀角3g，竹叶心3g，黄连5g，金银花9g，连翘6g，生地黄15g，玄参9g，麦冬9g，丹参6g组成。方中犀角已不入药，笔者改用羚羊角水解液代替。药物剂量按原方比例。处方中药材品种、产地经浙江中医药大学中药系鉴定。 羚羊角水解液制备：羚羊角用稀盐酸(浓盐酸用蒸馏水按1:4稀释)1800mL加热水解180min，合并药液于恒温水浴锅中浓缩至每毫升含羚羊角生药2g，再用氢氧化钠调至pH值为7。 清营汤制备：除羚羊角外中药按1:4比例加水，浸泡30min后，煎2次，每次30min，合并药液，滤出药汁，放置烧杯于恒温水浴锅适当浓缩，合并羚羊角水解液，将药液浓缩至每毫升含生药2g，装瓶密封消毒，冷藏备用。 2 实验方法 2．1　动物分组及大鼠热盛阴虚证心力衰竭模型的制备将100只雄性Wistar大鼠随机分为空白对照组(10只)和造模组(90只)。空白对照组大鼠每日自由饮水进食。造模组大鼠按0.85mg/(kgd)剂量连续皮下注射ISO 30天，然后将剂量增加至1.7mg/(kgd)继续皮下注射30天，同时加用TH 320mg/kg灌胃，隔天1次共15次。将造模存活大鼠(46只)随机分为ISO+TH组、清营汤低剂量组、清营汤中剂量组、清营汤高剂量组，各清营汤组分别给予小、中、大不同剂量清营汤灌胃，每日2次共30天。 2．2　给药方法　清营汤成人剂量设计为72g/60kg，按实验动物与人体体表面积剂量换算以确定大鼠清营汤给药剂量。中剂量为成人每公斤体重剂量的10倍，低剂量为中剂量的1/2，高剂量为中剂量的2倍。药物浓缩后1日2次灌胃，共给药30天。 2．3　大鼠心脏系数测定在90天实验结束时随机选取空白对照组大鼠8只及ISO+TH组、清营汤低剂量组、清营汤中剂量组、清营汤高剂量组存活大鼠8、8、10、10只，用电子称(感量0.5g)称取体重后予1％戊巴比妥钠25mg/kg麻醉，迅速打开胸腔取出心脏，冰盐水冲洗、滤纸吸干后用电子天平称全心重，用于计算心脏系数，大鼠心脏系数=全心重/体重×103。 2．4　大鼠心肌病理学观察　在测取大鼠心功能和心脏系数指标后再取大鼠左心室组织两块，分别置于－197℃液氮中保存。一部分心肌用于RT－PCR方法检测TNF－αmRNA及IL－1βmRNA。将另一部分心肌组织保存于10％中性甲醛溶液中固定，用于组织形态学检查。 石蜡切片的制作：心肌组织取材固定后，第3天更换10％中性甲醛溶液，1周后取出标本，进行修剪，然后冲水，梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡后石蜡包埋。超薄切