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细菌素PediocinPA-1融合蛋白表达纯化【摘要】 目的 在原核中表达和纯化融合蛋白。方法 IPTG诱导融合蛋白表达，表达的融合蛋白经金属镍离子螯合亲和层析纯化后，用分子筛Superdex G75进一步纯化和鉴定。结果 诱导表达后，通过SDS分析，融合蛋白主要存在上清中，金属螯合层析和分子筛纯化后，所得融合蛋白的纯度大于90%。结论 获得纯化的融合蛋白，为进一步研究和应用奠定基础。 【关键词】 细菌素；pediocinPA-1；融合蛋白 细菌素为许多乳酸菌产生的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白质物质。乳酸菌细菌素分为三大类[1]，pediocinPA-1为Ⅱa类细菌素，为小分子热稳定多肽，是一类重要的蛋白类抑菌物质，能抑制食物中的腐败菌和致病菌。本研究采用融合表达的方式，研究细菌素pediocinPA-1在大肠杆菌中的表达，并纯化pediocin PA-1融合蛋白，用于检测重组细菌素的生物学活性。 1 材料与方法 1.1材料大肠杆菌BL21和载体pET32b为Novagen公司产品，分子筛Superdex G75和Ni-NTA纯化试剂盒为GE healthcare产品。 1.2方法 1.2.1 融合蛋白的诱导表达 将构建好的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21，将鉴定的阳性克隆接种于LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。次日以1∶100的比例将培养物接种到LB中，37℃振摇培养2～3小时左右,至OD600达到0.8。加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，继续培养3小时。取诱导后样品超声破碎，离心收集上清和沉淀，进行SDS电泳。 1.2.2 融合蛋白的纯化融合蛋白主要以可溶性形式表达，用金属镍离子螯合亲和层析对可溶性融合蛋白纯化，经过超滤浓缩后，用Superdex G75分子筛层析柱进一步纯化，先用PBS平衡柱子，平衡后取金属螯合亲和纯化的融合蛋白上样，洗脱，分管收集蛋白峰并电泳分析。 2 结果 2.1重组质粒的酶切鉴定 重组的质粒经kpn I，Hind III酶切后，出现大小约为5.9kb和150bp两条DNA带，与表达载体和目的基因片段预期值相符 (图1)。表明pediocin PA-1基因已正确连接到表达质粒pET32b中。 2.2融合蛋白的诱导表达 经IPTG诱导后收集菌体，进行SDS分析。可见在相对分子量19kDa处有较清楚的条带。超声破菌后收集的上清和沉淀的SDS分析可见，融合蛋白主要存在于上清中，说明融合蛋白以可溶形式表达(图2)。 2.3融合蛋白的纯化 表达的融合蛋白经过亲和纯化后超滤浓缩，用分子筛Superdex G75精制，溶液pH7.4，取3、4号样品超滤浓缩(图3)，使蛋白的浓度达到1mg/ml以上，分装，冻干后4度保存备用。从SDS电泳图谱可见，纯化后仅有一条分子量约19kD的清晰区带，这一分子量与融合蛋白的分子量相吻合，薄层扫描分析证明，融合蛋白的纯度达90%。说明融合蛋白得到了较高程度的纯化(图4)。 3 讨论 细菌素的基础研究和相关的应用研究需要足量的细菌素。大肠杆菌表达系统为细菌素产生的重要途径，该表达系统在其它细菌素的表达研究方面已有应用。Ray等[2]将pediocin AcH的结构基因或者成熟肽基因克隆到载体pET-3c中，获得了具有活性的重组细菌素前体或者成熟细菌素。Richard等[3]设计合成divercin V41成熟肽基因，与载体pET-32b中的含有硫氧还蛋白基因的核苷酸序列融合，在大肠杆菌细胞质内表达可溶性的硫氧还蛋白。 细菌素是小分子肽易被酶降解,且不易检测。pET是一种高效的原核表达载体，它不仅具有强启动子序列，而且带有His-tag标签，用于检测和纯化融合蛋白，还可以改善融合蛋白的可溶性。将成熟piscicolin 126的基因与载体pET-32a进行克隆，在大肠杆菌中高水平表达硫氧还蛋白-piscicolin126融合蛋白[4]。 本实验将重组质粒pET32b-pediocin PA-1转化大肠杆菌BL21诱导后，获得了带有标签的小分子融合蛋白多肽，以可溶的形式表达。用金属鳌合层析和分子筛进行目的蛋白的纯化，检测到分子量19kDa 左右的蛋白条带，所得目的蛋白的纯度大于90%。为下一步研究它的生物学活性奠定基础。 参考文献 [1] Cintas LM,Herranz C,Hernandez PE,etal. Review: Bacteriocins of lactic acid bacteria[J].Food Sci Tech Int,2001,7:281-305. [2] Ray B,Schamber R, Miller KW.The p