胸段硬膜外阻滞联合中药对哮喘大鼠IL-12 GM-CSF影响 .docVIP

胸段硬膜外阻滞联合中药对哮喘大鼠IL-12 GM-CSF影响 姜廷枢　张碧海　刘　晓　赵丽红　张　丽　王　稳　薄志坚 摘　要：目的：探讨中药联合胸段硬膜外阻滞对哮喘大鼠肺泡灌洗液GM－CSF、血清中IL－12水平的影响。方法：将健康大鼠40只(雌雄各半)按随机数字表将其分为5组：空白组(A组)、哮喘模型组(B组)、中药组(C组)、胸段硬膜外阻滞组(D组)、胸段硬膜外阻滞+中药组(E组)。建立大鼠哮喘模型以及胸段硬膜外阻滞的模型，采用中药灌胃及硬膜外给药，用ELIsA法检测大鼠血清当中IL-12、肺泡灌洗液中GM-CSF水平的变化。结果：哮喘大鼠血清中IL-12水平明显降低，肺泡灌洗液中GM-CSF水平明显升高。中药与硬膜外阻滞以及二者的联合应用均可抑制IL-12水平的下降和GM-CSF水平的升高。二者联合应用组IL-12的下降、GM-CSF水平的升高低于中药组与单纯硬膜外阻滞组。中药组与单纯硬膜外阻滞组IL-12、GM-CSF含量无显著性差异。结论：胸段硬膜外阻滞联合中药对IL-12的下降及GM-CSF的升高有明显的抑制作用。 关键词：中药；哮喘；硬膜外阻滞；IL-12；GM-CSF 支气管哮喘是呼吸道慢性变应性炎症性疾病，其发病率及患病率不断上升。笔者建立胸段硬膜外阻滞联合中药对哮喘大鼠模型，检测大鼠血清中IL-12、肺泡灌洗液中GM-CSF的水平，从免疫学角度探讨其对哮喘的防治作用，从而为此方法应用于临床治疗哮喘提供理论和实验依据。 1 实验材料 1．1　实验动物选用健康SD大鼠40只(雌雄各半)，体重230―300g(由中国农业科学研究院哈尔滨兽医研究所动物实验室提供)，在室温18℃―28℃，相对湿度40％一70％的屏障系统内饲养。 1．2　主要仪器雾化吸入器；低温高速离心机；酶标仪；洗板机。 1．3　主要试剂卵蛋白(OVA)购自北京鼎国生物制品公司；AL(OH)，购自上海化工总厂；灭活百日咳菌苗由黑龙江省疾病预防与控制中心提供；IL-12、GM-CSF酶免检测试剂盒由上海森雄科技实业有限公司提供。 2 方法 2．1 实验大鼠分组 40只大鼠按雌雄各半随机分为5组，空白对照组(A组，n=8)；哮喘模型组(B组，n=8)；中药组(C组，n=8)；硬膜外阻滞组(D组，n=8)；硬膜外阻滞联合中药组(E组，n=8)。 2．2 哮喘大鼠模型的建立实验第1天B组、C组、D组和E组每只大鼠腹腔注射抗原混悬液(内含生理盐水加OVA10mg，AL(OH)3 100mg，灭活百日咳菌苗5×109个)ImL致敏；A组腹腔注射等量生理盐水。第8天重复上述操作。 2．3 连续硬膜外阻滞大鼠模型的建立 参照董有静等介绍的方法，根据实际情况作一定的改进，复制硬膜外阻滞大鼠模型。在第8-9日开始对D组、E组大鼠行硬膜外腔置管术并长期留置。用10％水合氯醛(4mL/kg)对大鼠进行腹腔注射麻醉，将麻醉后大鼠取俯卧位固定，消毒后，以大鼠第4～5椎体棘突为中心作一长约2cm纵行切口，分离脊突两侧筋膜及肌肉，用手术钳夹住脊突向上提，切断T4一T5问的韧带，将制备好的无菌导管经黄韧带破口插入，方向向头侧与脊柱纵轴平行，导管送入约2cm，如无清亮的脑脊液外溢即为位于硬膜外间隙。固定导管，避免感染及大鼠咬噬。 2．4　哮喘的激发中药灌胃及硬膜外给药第15天后。B组、C组、D组、E组开始用1％OVA(需新鲜配制)超声雾化吸入激发哮喘，每口1次，每次20min共7日。在每次激发前30min，C组、E组给予浓缩中药汤剂2mL(按体表面积公式)灌胃，D组、E组大鼠从第15天行硬膜外给药，每日注入0.125％Bupivicaine 25μL，8时，17时各1次。 2．5　取材及样品处理肺泡灌洗液的采集与处理：腹腔注射1.5％戊巴比妥钠(0.3mL/100g)麻醉后，开胸后气管插管，用生理盐水5mL注入气管肺组织内，反复抽吸3次，将抽取的肺泡灌洗液放入离心管中3000r/min离心5～10min。取上清液1mL用放置于放免用聚苯乙烯管中，上用塑料封口膜封好，用大头针刺满孔放置真空低温冷冻干燥箱中(-20℃)冷冻，待冻结后打开真空泵过夜(24h)，待成干粉后取出。 血标本的采集：在采集肺泡灌洗液同时，打开胸腔进行心脏取血。采集血液2mL。注入已加入的离心管中，然后立即在4℃、3500r/min离心15-20min，分离后的血浆在一20℃保存。 2．6　检测方法肺泡灌洗液检测之前用加入试剂盒中提供的缓冲液200μL，分别取100μL用于检测；血浆样品复融后在4℃、3500r/min离心15-20min，各取上清100μL用于检测。检测方法按试剂说明书进行。 2．7　统计学处理全部