骨髓基质干细胞复合纳米羟基磷灰石-聚乳酸构建组织工程骨.docVIP

骨髓基质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚乳酸构建组织工程骨刘雪梅 [摘要]目的：了解骨髓基质干细胞(MSCs)复合纳米羟基磷灰石／聚乳酸(n―HA／PLA)构建组织工程骨的异位成骨作用。方法：选择6只新西兰白兔，实验组于动物脊柱左侧肌肉内植入MSCs复合n―HA／PLA构建的组织工程骨，对照组于右侧植入n―HA／PLA生物材料。术后4、8周取材，行溴脱氧尿嘧啶(Brdu)标记细胞检测和组织学观察。结果：术后4周，实验组材料边缘均可检测到Brdu标记的MSCs。术后4、8周，实验组材料内部有新骨形成，随着时间推移，新骨量增多，编织骨向板层骨过渡。对照组材料未见新骨形成。结论：MSCs复合n―HA／PLA构建的组织工程骨具有很好的异位成骨作用。 [关键词]骨髓基质干细胞；纳米羟基磷灰石；聚乳酸；组织工程 [中图分类号]Q813　[文献标识码]A　[文章编号]1008―6455(2007)01―0025－03 目前对骨组织工程支架材料的研究很多，但尚未找到，种理想的材料。单一类型的支架材料存在各自的优缺点，仅靠单一材料很难满足骨组织工程支架材料的要求。理想的骨组织工程支架材料的制备应考虑到无机陶瓷类材料、合成聚合物材料和天然生物衍生材料的优缺点，将有机材料和无机材料通过合适的方法组合成复合材料，模拟天然骨基质组成成分，通过促进种子细胞的粘附、增殖和分化，从而发挥最佳的成骨能力。纳米羟基磷灰石／聚乳酸(n―HA／PLA)就是根据这一原理将无机材料纳米羟基磷灰石与有机材料聚乳酸通过特殊工艺聚合而成的新型生物材料，本实验旨在研究复合生物材料n―HA／PLA作为组织工程支架材料的可行性。 1　材料和方法 1．1 MSCs的分离培养与诱导：取健康新西兰白兔2只，双侧胫骨结节处备皮消毒，无菌条件下用骨穿针穿刺抽取红骨髓8ml，加入含肝素的DMEM培养液(Gibco公司)，混匀后加入3ml淋巴细胞分离液(Gibco公司)，1800r／min离心10min，吸除中间层细胞后再离心，所得细胞沉淀以1×106／ml密度接种于含15％胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养。待细胞相互融合达90％生长面积时用0．25％胰蛋白酶(Sigma公司)消化传代培养。细胞传至3代时，移入含10～8mol／L地塞米松、50mg/L维生素C和10～2mol／Lβ－磷酸甘油钠的DMEM培养液诱导培养3天，诱导后的细胞表型经鉴定为成骨样细胞。移入含0．2％BrdU的无血清培养液(按200μl BrdU／100ml DMEM培养液的比例配制)中，于37℃、5％C02饱和湿度条件下培养1h标记细胞。 1．2组织工程骨的制备：n-HA／PLA由美国印第安那大学医学院生物工程研究室提供，材料规格为１5mm×10mm×5mm大小，环氧乙烷消毒后备用。将n-HA／PLA支架材料用DMEM培养液浸泡1天后弃残液，每个支架材料以1×106／ml密度接种经诱导培养的MSCs，于37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养3天。术前清晨更换不含青霉素和链霉素的无血清培养液。 1．3动物模型和实验分组：6只新西兰白兔全身麻醉，常规消毒颈背部，于脊柱棘突两侧各作长约2cm切口，依次切开皮肤和皮下组织，显露肌组织，分开肌间隙，将移植材料植入肌腹内，逐层缝合切口。实验动物自身作对照，于动物脊柱左侧肌肉内植入组织工程骨，右侧植入单纯支架材料。 1．4　检测项目 1．4．1大体观察：术后观察动物饮食、活动，伤口有无肿胀、分泌物等。术后4周处死动物，取出移植材料，观察移植物的颜色、质地和血管形成，与周围软组织分布情况。 1．4．2 BrdU标记细胞检测：术后4周部分标本经4％多聚甲醛固定1周后，乙醇梯度脱水。有机树脂包埋，硬组织切片机制作厚度为5μm切片标本，用免疫组化的方法检测标记细胞。切片标本用0．3％H2O2一甲醇处理30min灭活内源性氧化酶，5％正常兔血清封闭，甲酰胺100℃变性核酸5min，冰浴冷却后PBS洗涤，加工作浓度为1：50的小鼠BrdU单克隆抗体。阴性对照以PBS代替一抗。显微镜下观察，细胞核内棕色颗粒为阳性细胞。 1．4．3组织学观察：标本经4％多聚甲醛固定，用10％EDTA脱钙，常规脱水、浸蜡和包埋，石蜡切片厚度5μm，行HE染色，显微镜下观察植入材料内新骨形成的情况。 2　结果 2．1大体标本观察：术后8周，各组植入材料周围软组织未见坏死、化脓、积液等现象，可见各组材料有大量纤维组织和血管等软组织包裹和长入，很难将其分离。 2．2 BrdU标记细胞检测：将BrdU标记的MSCs与n-HA／PLA支架材料复合物植入动物体内，术后4周取出标本，免疫组化方法检测标记细胞，支架材料边