微生物的染色试验指导试验类型：验证性试验学时：3试验要求：必做.PDF

《微生物的染色》实验指导 《微生物的染色》实验指导 《《微微生生物物的的染染色色》》实实验验指指导导 实验类型： 实验学时： 实验要求： 实验类型： 实验学时： 实验要求： 实实验验类类型型：：验证性 实实验验学学时时：：3 实实验验要要求求：：必做 一、实验目的 一、实验目的 一一、、实实验验目目的的 1.了解微生物的染色原理、染色的基本操作技术。 2.掌握微生物的复杂染色法即革兰氏染色法的操作步骤。 二、实验内容 二、实验内容 二二、、实实验验内内容容 革兰氏染色法是鉴别细菌的重要的染色方法，属于微生物学中的复杂染色法，经过革兰 氏染色之后，细菌被分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，从而初步分辨出微生物的种类。 三、仪器设备 三、仪器设备 三三、、仪仪器器设设备备 光学显微镜、接种环、载玻片、酒精灯、擦镜纸、吸水纸 四、所需耗材 四、所需耗材 四四、、所所需需耗耗材材 草酸铵、结晶紫、碘、碘化钾、95％酒精、蕃红等。 菌种：大肠杆菌或枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等。 五、实验原理、方法和手段 五、实验原理、方法和手段 五五、、实实验验原原理理、、方方法法和和手手段段 微生物（尤其是细菌）的机体是无色透明的，在显微镜下微生物体与其背景反差小，不 易看清微生物的形态和结构，若增加其反差，微生物的形态就可看得清楚。通常用染料将菌 体染上颜色以增加反差，便于观察。 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组成。细菌等电点在 pH = 2 －5之间，在中性（pH=7）、碱性（pH＞7）或偏酸性（pH＝6－7）的溶液中，细菌的等电点 均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性 染料染色的为多。碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿 和番红等。 革兰氏染色法是细菌学中很重要的一种鉴别染色法。它可将细菌区别为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两大类。 革兰氏染色的机理：细菌细胞经草酸铵结晶紫初染及碘液媒染后，在细胞臂及细胞膜上 结合了不溶于水的结晶紫－碘的大分子复合物。革兰氏阳性菌的细胞臂较厚，肽聚糖含量较 高，分子交联度紧密，故酒精脱色时，肽聚糖网孔会因脱水而收缩，将结晶紫－碘的复合物 阻留在细胞臂上而使细胞呈蓝色，复染亦不上色。革兰氏阴性菌的细胞臂较薄，肽聚糖含量 低且结构松散，与酒精反应后肽聚糖不易收缩，同时其脂类含量多且位于外层，酒精易将细 胞臂溶出较大的空洞或缝隙，结晶紫－碘的复合物易被溶出细胞臂，脱去初染颜色，从而被 沙黄复染液染成红色。 六、实验步骤 六、实验步骤 六六、、实实验验步步骤骤 （一）细菌的单染色步骤 标片的制作应执行无菌操作，接种环取菌前应进行灭菌，灭菌操作如图-1所示。标片 的制作及细菌染色操作过程如图-2所示。 1.涂片 取干净的载玻片于实验台上，在正面边角作个记号，按无菌操作的方法取一小滴菌液 于载玻片中央（如菌种在固体培养基上，则滴一滴无菌蒸馏水于载玻片的中央，从斜面挑取 少量菌种与玻片上的水滴混匀后），在载玻片上涂布成一均匀的薄层，涂布面积不宜过大。(注： 活性污泥染色是用滴管取一滴活性污泥于载玻片上铺成一薄层即可。） 2. 干燥 最好在空气中自然晾干，为了加速干燥，可在微小火焰上方烘干。但不宜在高温下长时 间烤干，否则急速失水会使菌体变形。 3. 固定 将已干燥的涂片正面向上，在微小的火焰上通过2－3次（以玻片与手接触感到稍微烫 手为度）。由于加热使蛋白质凝固而固着在载玻片上不易脱落，同时固定也可使标本容易着 色。 4. 染色 在载玻片上滴加染色液（石炭酸复红、草酸铵晶紫或美蓝任选一种），使染液铺盖涂有 细菌的部位作用约1min。 5. 水洗 倾去染液，斜置载玻片，在自来水龙头下或用洗瓶用小股