实验三产果胶酶菌株的筛选.docVIP

本科学生综合性实验报告 学号 084120155 姓名 张 琰 学院 生命科学学院 专业、班级 08生技班 实验课程名称 发酵工程学实验 教师及职称 唐湘华（高级助理实验师） 开课学期 2010 至 2011 学年 上 学期 填报时间 2010 年 12 月 28 日 云南师范大学教务处编印 一、实验设计方案 实验序号 三 实验名称 产果胶酶菌株的筛选 实验时间 2010.12.13-12.23 实验室 基础生物2（121） 1．实验目的 1.1 掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法； 1.2 了解酶学性质的研究。 2． 实验原理、实验流程或装置示意图 2.1 实验原理： 2.1.1 果胶酶概况 2.1.1.1 果胶质： 是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。 果胶酶： 是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。 产生果胶酶的微生物： 细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。 2.1.1.4 果胶酶的应用： 主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。 2.1.2 果胶酶的酶活测定方法 2.1.2.1粘度降低法： 利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。 2.1.2.2 脱胶作用时间法： 以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。 2.1.2.3次亚碘酸法： 用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。 2.1.2.4还原糖法（DNS法）： 测定在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，水解果胶产生的还原糖的量。 测定原理： 根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。 2.1.3 微生物发酵生产产品受以下条件制约： 培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子； 培养条件：温度、pH、溶解氧等； 附加条件：诱导物、表面活性剂等。 2.1.4 酶催化反应的进行受多种因素的影响： 底物浓度；酶浓度 ；温度；pH；激活剂；抑制剂。 2.1.5 酶活定义： 在pH3.0、 37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol半乳糖醛酸所需要的酶量为一个酶活单位U/g。 2.2 实验流程： 产果胶酶菌种的筛选 ↓ 果胶酶的分离纯化培养 ↓ 测定筛选出的果胶酶的酶活 3．实验设备及材料 3.1 菌种筛选使用的培养基： 3.1.1 基本培养基： 果胶1.0% 、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1.0%、琼脂2.0%，pH4.5 3.1.2 分离培养基： 果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%，pH4.5 3.1.3 发酵培养基 果胶1.0% ，磷酸氢二钠0.5%，蛋白胨1.0%，pH4.5 3.2 酶活测定使用的试剂： 3.2.1 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液： 称取柠檬酸15.652g，柠檬酸钠7.5g，溶解定容至1000ml，用0.1M NaOH 或0.1M HCl 调节pH至3.0。（共配3000 ml，分装6瓶） 底物——0.25%果胶溶液： 称取0.25g果胶，用上述缓冲液溶解，在电炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至100mL，储存于4℃，7天内有效。 （共配200ml） DNS试剂： 称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500 mL水中，加热（不超过50℃），于热溶液中依次加入3-5 二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g，苯酚5.0g，无水硫酸钠5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容至1000 mL，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后过滤使用。 3.3 实验仪器： 烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等； 天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、 记时器（精确到秒）、分光光度计等。 4．实验方法步骤及注意事项 4.1 实验步骤： 4.1.1 产果胶酶菌种的筛选： ① 菌种采集： 到卖水果处寻得一其上有菌体生长的桔子，备用，作为菌种采集来源。 ② 基本培养基的配置 配制基本培养基，并用灭菌锅灭菌，备用。 倒平板（每组两块） 分离菌种 在无菌操作台内操作，用接种环刮取桔子皮上的菌体，以“之”字型在平板上划线，每组划两块板。然后放置于恒温箱中培养至菌体产生。 菌种纯化 配制分离培养基，