出现的新一代测序技术.PPT

DNA测序技术DNA Sequencing 三峡大学医学院 盛 德 乔 shengdq@ 人类基因组计划（Human genome project, HGP）用了大约10年的时间，各国政府相继投入了几十亿美元，才完成了人类个体全基因组序列的测序工作。而2005年以来，出现的新一代测序技术，却可在1个月内，花费十几万美元就可完成一个人类个体全基因组序列的测序工作。现在，美国、欧洲等各大生物技术公司、大型生物医药研究机构等投入大量的人力物力开始了新一轮的下一代测序技术的技术竞赛，力争实现1000美元完成一个人的全基因组序列的测序，加速个人基因组时代的到来。 一、DNA测序技术概述 DNA测序——核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 核苷酸的排列顺序 碱基的排列顺序 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定。 70年代后期，Sanger和MaxamGilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和MaxamGilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。 测序技术的发展历史 双脱氧末端终止法 (Sanger 测序法) 1970s 同位素标记，手工 1980s 荧光标记，自动 1990s 毛细管电泳 合成测序法（第二代测序） 焦磷酸测序（Pyrosequencing, Roche/454） 合成测序（Sequencing-By-Synthesis, Illumina/Solexa） 连接测序（Sequencing-By-Ligation, ABI/SOLiD） 单分子测序技术（第三代测序） Helicos Pacific Biosciences Oxford Nanopore 二、 第一代测序方法 测序的基本过程 制备待测DNA序列模板； 酶促或化学反应将其转变“等差数列”（n=1）； 电泳PAGE； 读序。 原 理 用放射性核素标记待测DNA一侧末端 将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列 反应产物电泳 放射自显影 阅读 Sanger双脱氧末端终止法 原理 DNA链的合成反应，只不过反应体系中加入了四种双脱氧核糖核苷酸（ddNTP）中的一种。 在DNA链合成过程中ddNTP会代替部分dNTP作为底物进行DNA合成反应。 一旦ddNTP掺入到合成DNA链中，正在延伸的DNA链将终止。 经电泳分离，放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列 反应体系 引物 模板：纯单链DNA和经过热变性或碱变性的双链DNA DNA聚合酶：Klenow大片段 放射性同位素标记的dNTP：32P-dNTP、α-32S-dNTP ddNTP 用于测序的变性凝胶电泳： 胶长40cm 化学降解法程序复杂 后来逐渐被Sanger法代替 这２种方法都需要放射性同位素标记 操作繁琐 不能自动化不能满足大规模测序的要求。 到了20世纪80年代末 研究人员逐渐利用荧光标记代替同位素标记测序 产物，经过平板电泳分离 荧光分子在激光的激发下可以发射出不同波长的荧 光 ，根 据 荧 光 信 号 可 以 确 定DNA序 列。 毛细管电泳 基本原理： 与链终止法测序原理相同，只是用不同的荧光色彩标记ddNTP，如ddATP标记红色荧光,，ddTTP标记绿色荧光，ddCTP标记蓝色荧光, ddGTP标记黄色荧光，由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色，而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。 DNA自动测序结果举例 目前所用测序技术的缺点 测序的原理是DNA链终止法，这注定了一个反应所测序列不可能太长，目前为1000个核苷酸左右。 测序反应费时费力 科学家们完成第一个人类基因组测序整整花了13年的时间，耗费了30亿美元的费用。 测序准确度不高 DNA聚合酶造成的碱基错配，DNA序列判读错误。 测序基于PCR反应，需要引物，并且有些些结构复杂的难于进行PCR反应的片段不能测序。 三、 第二代测序技术 第二代测序技术——循环阵列合成测序法 新一代测序技术（Next Generation Gequencing，NGS） 代表技术为 罗氏公司(Roche)的454测序仪(Roche GS FLX sequencer) （2005） Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Ana