医学细胞生物学 第02章 研究方法.ppt

研究方法和手段 1.光学显微镜 2.电子显微镜 3.扫描探针显微镜 THANKS !! 基本原理： 激光 在一定的营养条件下将细胞在体外进行培养，使之继续生长增殖的过程。 基本材料与器材： 培养容器，培养基，血清，CO2培养箱，超净工作台，倒置显微镜 二、细胞的分离和培养 3.细胞培养（ cell culture ） 超净工作台 CO2培养箱 细胞培养无菌操作 细胞体外生长的条件: 1）需要营养; 2）适宜温度、湿度; 3）适宜的pH值; 4）无菌的环境以及支持物. 二、细胞的分离和培养 3.细胞培养（ cell culture ） 传代培养( subculture cell) ： 将细胞按一定的比例转瓶扩大培养。 原代培养(primary culture cell)： 直接从机体取下细胞、组织 和器官后立即进行培养。 二、细胞的分离和培养 3.细胞培养（ cell culture ） 细胞系中挑出一个细胞，培养形成的克隆。 原代培养的细胞经传代成后就叫细胞系 。 细胞系(cell line)： 细胞株(cell strain)： 二、细胞的分离和培养 3.细胞培养（ cell culture ） 500 HUVEC 人脐静脉内皮细胞 400 HEK293 人胚肾细胞 正常人 细胞 400 CHO 仓鼠卵巢细胞 400 NIH/3T3 NIH Swiss鼠肺成纤维细胞 400 3T3-Swiss 鼠胚胎成纤维细胞 正常动物 细胞 400 SP2/0 小鼠骨髓瘤 400 PC-12 大鼠嗜铬细胞瘤 动物肿瘤 400 Hela 宫颈癌 400 MCF-7 乳癌 人肿瘤 价格 代号 细胞株名称 细胞株类型 细胞系/株 破坏细胞膜 低渗 超声振荡 机械研磨 各种细胞器 及大分子 离心 层析 电泳 生物质普技术 匀浆 三、细胞组分的分级分离 其他分子生物学技术 离心分离技术： 差速离心 移动区带离心 分离细胞器、生物大小分子常用的技术，根据各 种颗粒或大分子的大小、密度的不同进行分离。 等密度离心 三、细胞组分的分级分离 速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀 差速离心 低速 较高速 高速 离心分离技术： 三、细胞组分的分级分离 等密度离心 移动区带离心 细胞融合技术 四、细胞工程技术 细胞核移植技术 干细胞研究技术 * * Hela cell 医学细胞生物学 100μm 100nm 1 nm 一、显微技术 普通光学显微镜 相差显微镜 微分干涉差显微镜 荧光显微镜 激光扫描共聚焦显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 普通光学显微镜 最大分辨率，0.2um 原理： 利用一组透镜将标本连续放大。 一、显微技术 1.光学显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 分辨率或分辨力 在人的明视距离25cm处，能清楚的分辨两点的最小间隔的能力，用R来表示。 R=0.61λ /nsinα 0.00387 0.0122 0.123 13~390 390~760 波长nm 100kv电子束 10kv电子束 0.1kv电子束 紫外光 可见光 光线名称 一、显微技术 普通光学显微镜 聚光器 目镜 标本 反射棱镜 光源 物镜 普通光学显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 标本制备： 取材 固定 染色－观察 直接涂片 甲醛、戊二醛、乙醇 包埋切片 (固定) 普通光学显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 口腔上皮细胞 血细胞 Fulgen染色 2）应用： 主要观察活细胞 倒置相差显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 1）利用光的衍射和干涉效应 神经母细胞 10X40 10X60 倒置相差显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 倒置相差显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 荧光显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 微管呈绿色、微丝红色、核蓝色 微管呈绿色 染色体呈蓝色 荧光显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 原理： 物镜 标本 分光镜 滤光片 滤光片 光 源： 紫外光 标本内的荧光分子： 标本自身含有荧光物质 用荧光物质标记标本 检测细胞表面或细胞内特定的抗原 应用： 特点： 荧光显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 荧光检测 细胞结构的三维重建 应用： 激光共聚焦扫描显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 原理： 激光共聚焦扫描显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 共聚焦针孔 物镜的焦平面 光源针孔 物镜 检测器 分光镜 激光光源 激光共聚焦扫描显微镜 一、显微技术 1.光学显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 一、显微技术 2.电子显微镜 透射电子显微镜 成像原理: 电子束穿透样本而成像 应用: 观察细胞内部超微结构 一、显微技术 2.电子显