3种条件性致病菌三重PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

中国畜牧兽医 2015 ,42(6):1389-1395 China Animal H usbandry Veterinary Medicine doi: 10. 16431/j. cnki.1671-7236. 2015. 06. 010 3 种条件性致病菌三重 PCR 检测方法的 建立及初步应用 冯洁，谢建云，胡建华，高诚普 (上海实验动物研究中心，上海市实验动物质量监督检验站，上海 201203) 摘 要:本研究旨在建立一种能同时检测金黄色葡萄球菌(Staρhylococcus aureus , 5. aureus) 、绿腋杆菌(Pseudo monas aeruginosa ,P. aeruginosa) 、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae ,K. pneumoniae) 的三重 PCR 检测方法。 根据金黄色葡萄球菌 nuc 基因、绿旅杆菌 toxR 基因、肺炎克雷伯杆菌 PhoE 基因设计并合成引物，在单-PCR 条 件基础上优化建立三重 PCR 反应条件，并进行特异性、敏感性和重复性分析及与细菌分离培养的比对试验。结果 显示，3 对引物均能特异性扩增出目的条带，大小分别为 484 、 278 和 368 忡。最佳退火温度在 56~59 .C 之间，引物 2 浓度均为 0.2μmol/L ， dNTP 浓度为 200μmol/ L， Mg 十浓度为 2.5 mmo l/L. 3 种细菌间无交叉反应。对支气管鲍 特杆菌等其他 8 种实验动物常见致病菌均无交叉反应。最低能同时检测到 10→ ng/μL 的细菌基因组 DNA 3 次 o 重复结果一致，表明建立的三重 PCR 方法重复性好。同时采用细菌分离培养法和三重 PCR 方法对 30 份实验小鼠 样本进行检测，对比结果显示三重 PCR 方法检出率略高于细菌分离培养法，细菌分离培养法呈阳性的样品，三重 PCR 方法均能检出。结果表明，本试验建立的三重 PCR 检测方法具有特异、敏感、高效等优点，为实验动物细菌快 速检测和流行病学调查提供了技术支持。 关键词:三重 PCR; 金黄色葡萄球菌;绿腋杆菌F 肺炎克雷伯杆菌 中图分类号:Q78 文献标志码:A 文章编号: 1671-7236(2015)06-1389-07 Establishment and Preliminary Application of Triple PCR to Identify Three Kinds of Conditional Pathogenic Bacteria FENG Jie , XIE Jian-yun , HU Jian-hua , GAO Cheng普 (Shanghai Quality Monitoring Center 01 Laborαtory Animals , Shanghai Laboratory Animal Research Center , Shanghai 201203 , China) Abstract: The aim of this study was to establish a simultaneous triple PCR detection method for Staphylococcus aureus (S. aureu仆 • Pseudomonas aer