2012年发现的新冠状病毒分子检测方法的建立与探针优化.pdfVIP

中华实验和l临床病毒学杂志 2012 年 12 月第 26 卷第 6 期 Chinese J Exp Clin Virol ,December 2012 ,Vo l. 26 ， Nι6 .401 . ·论著· 2012 年发现的新冠状病毒分子检测方法的 建立与探针优化 周为民，陆柔剑，耿合员，李辉，段希洁，杨扬，谭文杰 [摘要] 目的 建立 2012 年确定的新冠状病毒的分子检测方法，并筛选优化引物与探针。 方法 依据最先发表的 208 bp 长的新冠状病毒 1b 片段核酸序列，比对分析后设计合成常规 RT-PCR 引物 1 对及荧光定量 RT-PCR 引物 1 对与 TaqMan 探针 2 条(TZ1 ， TZ2) ，同时合成锁核酸修饰的 TaqMan 探针2 条(LNA-TZ1 ， LNA-TZ2) 。建立检测新冠状病毒感染的常规 RT-PCR 方法与 4 种荧光 定量 RT-PCR ，分析比较其灵敏度与特异性，同时参照欧洲发表的 2 种荧光定量 RT-PCR 引物与探针 对(upE ， ORFlb) 建立相应方法，以合成的阳性模板比较6 对荧光定量 RT-PCR 引物与探针的检出灵 敏度。结果 所合成的常规 RT-PCR 与荧光定量 RT-PCR 引物与探针皆有较好特异性，不能扩增其 他人冠状病毒模板及常见呼吸道病毒模板，检出下限达到 -500 拷贝/反应。锁核酸修饰 TaqMan 探 针可改善荧光定量 PCR 检测方法的反应性能，经锁核酸修饰的 TaqMan 探针与常规 TaqMan 探针相 比，检出率提高 10 倍左右，其中 LNA-TZl 与 upE 探针对具最佳反应性能。结论 本研究所建立的常 规 RT-PCR 与荧光定量 RT-PCR 可用于新冠状病毒的分子检测，并推荐使用 LNA-TZ1 与 upE 探针对。 本研究为新冠状病毒分子检测方法应用与改进奠定了基础。 [主题词} 冠状病毒属; 分子诊断技术; 核酸类 Molecular detection assays ror 2012 identified novel human coronavirus (HCoV) and probe modification with Locked nucleic acid( LNA) ZHOU Wei-min ,LU Rou-jian , GONG He-yuan , LI Hui , DUAN Xi-jie , YANG Yang , TAN Wen-jie. • National Institute for Viral Diseαse Control and Prevention , Chinese Centerfor Disease Control and Prevention ,Beijing 102206 ,China Corresponding author: TAN Wen-jie , Emαil: tanwJ28@ yahoo. com [Abstract 1 Objective To develop and optimize the molecular detection assays for recently identified human coronavirus (HCoV) infection. Methods Based on the 208 base pair( bp) sequence of novel HCoV reported by HPA ofUK , we designed and obtained several pairs ofprimer(F-l , R-l;F-2 , R-2) and Taqman probes( TZl ,TZ2) for detection of novel HCoV. Two of probes were modified with LNA( LNA- TZl ,LNA-TZ2). Then , RT-PCR and various real time RT-PCR assays were developed and optimized in this study.