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CPE上调促进结肠直肠癌中的细胞增殖和致肿瘤性 一、背景 结直肠癌(CRC)是最常见的癌症之一,是与癌症死亡相关的主要原因。据世界卫生组织统计，在2008年全世界范围内有将近120万例CRC患者。CRC发展是一个多步骤、多基因的过程,涉及到癌基因的激活、超表达以及失活。这些肿瘤抑制基因在CRC肿瘤的发展过程中有多重影响,包括细胞增殖、凋亡、入侵和转移。基因突变的肿瘤抑制器,腺瘤息肉病杆菌(APC)，是关于CRC最有效的研究之一。 家族性瘤息肉病(FAP)，一个较多见的常染色体遗传疾病，在一个病人生命的二十到三十年之内会引起成百成千上万的结直肠肿瘤细胞的发展。生殖系在APC突变大约80%的FAP时会影响个人。据报道许多其他癌基因蛋白能调节或激活CRC，如FOXQ1，PIK3CA，和细胞周期蛋白D1。尽管CPE作为一种激素原/神经肽原加工酶 ，已经被报道在CRC中会升高，但它在肿瘤发展中扮演的角色仍知之甚少。 CPE主要存在于内分泌和神经内分泌细胞,是一种金属外肽酶。它编码的一个羧肽酶，能劈开c端氨基酸残基,在糙面内质网中作为前提合成并参与肽激素和神经肽的生物合成。在打包成分泌颗粒后，这些前体被有序地加工。首先，通过激素原转化酶(PC1/3和PC2)消除羧基端成对的基本残留，以获得残留扩展肽，然后通过CPE的一个可溶性小集团去分开这些基本残留，获得具有生物活性的肽类激素和神经肽。CPE也有为受监管的分泌途径提供激素原排序受体的功能。具有Cpe突变或Cpe基因敲除的小鼠，会显示出病理生理状况，如肥胖、糖尿病、不孕症、低骨密度以及在学习和记忆上的缺陷。对于人类来说，管制CPE与多种疾病有关,如糖尿病、阿尔茨海默病和癌症。Horing等人发现CPE在胶质母细胞瘤的表达降低,并建议将CPE用做一个假定的肿瘤抑制基因。相反，Murthy等人认为，在许多人类癌症患例中CPE显著升高，它的上调与肿瘤的生长和转移密切相关。因此，CPE在癌症上的作用仍不清楚。 在这篇文章中，我们发现CPE在CRC细胞系和肿瘤组织中都会显著提高。进一步的调查显示，超表达的CPE会导致周期素依赖性蛋白激酶(CDK)抑制剂p21和p27的减少和CDK调节器细胞周期蛋白D1的增加。肿瘤细胞比率的上升能表明CPE在增强细胞增长率和CRC细胞致肿瘤性活动中的作用。这些结果表明,CPE可能是CRC疗法的新目标。 二、方法 道德申明 以临床使用的材料为研究目的，获得的样本应事先书面通知病人，获得其同意和增城人民机构研究伦理委员会的批准。 细胞系和组织标本 CRC细胞系包括SW480, SW620, KM12, HCT15, HCT116, Caco-2和LoVo是在RPMI1460培养基中培养(Invitrogen, Carlsbad, CA, US) ，并补充10%的FBS (HyClone, Logan, Utah, US)。这些新鲜的组织标本是从增城人民医院(中山大学博济附属医院)采集的，并进行了组织病理学和临床诊断。 质粒和抗体 CPE的表达：从HTC166细胞获得的人类完整的CPE cDNA经过PCR的放大，克隆到一个pMSCV-puro逆转录线路。损耗的CPE:两个人的shRNA序列克隆到pSuper-retro-puro质粒以获得pSuper-retro CPE shRNA。以下被选用的序列：RNAi # 1,CTCCAGGCTATCTGGCAATAA;,GATAGGATAGTGTACGTGAAT RNAi # 2。CPE抗体(BD, Franklin Lakes, New Jersey, US)，β-肌动蛋白抗体(Upstate, Temecula, CA, US)，和溴脱氧尿苷抗体(美国北部泰梅库拉,CA)被用于免疫印迹分析和溴脱氧尿苷公司化验。 RNA提取、逆转录(RT)和实时荧光定量聚合酶链式反应 使用试剂盒试剂提取的培养细胞总RNA (Invitrogen, Carlsbad, CA, US)，需遵循生产商的说明书。使用ABI棱镜7500序列检测系统(Applied Biosystems, Foster City, CA)和荧光染料(Molecular Probes, Invitrogen, CA Carlsbad, CA, US)将cDNA放大、量化。以下引物选择：CPE:CCATCAGCAGGATTTACACG(向前)和TAAATTCAGGCTCACCAGGC(反向)；p21：CGATGCCAACCTCCTCAACGA(向前)和TCGCAGACCTCCAGCATCCA(反向)；p27：TGCAACCGACGATTCTTCTACTCAA(向前)和CAAGCAGTGATGTATCTGATAAACA AGGA(反向)；细胞周期蛋白D1：AACTACC