FANCF-shRNA表达质粒的构建及MCF-7-FANCF-RNAi瞬时转染细胞模型的建立.pdfVIP

中国医科大学学报第40 卷第8 期2O11 年8 月 .676. Joumal of China Medical University Và.4O No.8 Aug. 2011 FANCF-shRNA 表达质粒的构建及 MCF-7-FANC乒RNAi 瞬时转染细胞模型的建立 唐宏涛，何苗，李娜，孙海刚，余涧坤，郝俊莹，魏敏杰 (中国医科大学药学院药理学教研室，沈阳 II∞01) 摘要 目的 构建针对人FANCF基因的 shRNA 表达质粒 (FANCF-shRNA) ，转染 FANCF-shRNA 使人乳腺癌 MCF-7 细胞 FANCF基因沉默，从而建立 MCF-7-FANCF-RNAi 瞬时转染细胞模型。方法 实验分两部分:FANCF工shRNA 表达质粒的构建: 根据相关文献报道，使用 Ambion 公司的在线设计软件，设计并合成能够编码针对 FANCF 基因的小发夹 RNA(FANCF工shRNA) 的 DNA 模板，将其插入到 p Sliencer™ 4.1-CMV neo 表达质粒中，形成 pSliencer™ 4.1-CMV-FANCF-shRNA 重纽质粒;将该重纽 质粒转化到 E coli 感受态细胞 JM109 中，通过氨爷青霉素抗药性筛选出成功转化的阳性克隆，并进行扩增;通过 PCR 及基因 测序方法筛选出插入正确的 FANCF工shRNA 表达质粒;MCF平FANCF-RNAi 瞬时转染细胞模型的建立:碱裂解法提取FANCF工 shRNA 表达质粒，通过脂质体介导将该质粒转染入人乳腺癌 MCF-7 细胞中，RT-PCR 法检测 FANCF 基因 mRNA 表达水平，确 认 FANCF 基因沉默。结果 含有重组质粒的阳性克隆菌液 PCR 扩增片段约为 250 坤，并且其基因测序结果显示插入片段碱 基排列顺序正确，没有突变，说明 FANCF工shRNA 表达质粒构建成功;与阴性对照纽相比，转染 FANC且shRNA 质拉后第 2 天、 第 3 天、第 5 天和第 7 天， FANCF 基因 mRNA 表达水平均明显减低，表达抑制率分别为 (36 .5 1:1:6.84 )%、 (37.03:1:6.61 )%、 (53.03 :1:9.33 )%和(39.51 :1:lO.13)%(P 0.05) ，说明 FANCF基因沉默，MCF平FANCF-RNAi 瞬时转染成功建立。结论 成功构 建了 FANCF工shRNA 表达质粒并建立 MCF平FANCF-RNAi 细胞模型，为研究 FANCF基因在乳腺癌发生发展及耐药产生与调控 中的作用奠定实验基础。 关键词 人乳腺癌 MCF-7 细胞; FANCF基因; RNAi 中图分类号 R737.9 文献标志码 A 文章编号 0258-4646(2011)08-0676-05 doi CNKI:21-12271R1657.012 网络出版地址 lkcms/detaiV21.1227.R1657.0 12.html Cons衍uction of FANι:F-shRNA Expm画ng Plasmids and Establishment of MCF平FANCF-RNAi Transient Transf配tion CeII Model TANG Hong-tao , HE M邸，U Na , SUN Hai-gang , YU Jian-kun , HAO Jun-yi吨， WEI Min-Jie (Department of pharmacol咽，School of Phannacy, China Medical University ,Shenyang llOOOl ,China) A阳市曰.ct Obj缸tive To construct FANCF-shRNA expressing plasmids and transfect them into MCF-7 cells to make FANCF gene si- lence and to establish MCF平FANCF-RNAi transient transfection