三种家禽病毒多重RT-LAMP检测方法的建立与应用.pdfVIP

• 2 • 《上海畜牧兽医通讯)) 2016 年第 1 期 三种家禽病毒多重 RT-LAMP 检测方法 的建主与应用 陈 兵I 孙洁2 陈书混l 曾少灵2 林庆燕1 刘建利2 陶 虹l 曹琛福2 阮周曦2 吕建强1 杨俊兴l 吴绍强3 卢体康l 秦智锋1 铸 ( 1 深圳出入境检验检疫局 深圳 518045 2 深圳市检验检疫科学研究院 深圳I 518001 3 中国检验检疫科学研究院 北京 100176 ) 【摘要】 LAMP 检测方法由于具有扩增速度快、现场检测的潜力而备受关注。但目前的研究多 是聚焦于单重 LAMP 扩增，只能进行单个目标的检测。本研究首次将禽流感、新城疫和传染性法 氏囊三种病毒性疾病作为一个检测整体，建立了对三种疫病同时进行筛选检测的多重 RT-LAMP 检测方法。本研究首先通过减少 LAMP 标准反应体系中的外引物来减少引物之间的相互千扰;其 次以 Calcein 为核酸染料，建立了禽流感、新城疫和传染性法氏囊三种病毒实时荧光多重反转录环 介导等温扩增(multiplex real-time reverse transcription-LAMP , mRT-LAMP) 检测方法;二是对 该法特异性、敏感性及准确性进行了评价。试验结果显示:所建立的 mRT-LAMP 检测方法可对 AIV、 NDV和 IBDV 同时进行筛选检测，灵敏度可达到 10 个基因拷贝，与单重 LAMP 检测的灵敏 度相当;所建立的方法特异性强，与其他病原体无交叉反应;小规模田间试验显示该法可用于三种 病毒的快速筛选检测，结果准确可靠。结果表明:本实验建立的 mRT-LAMP 检测法可满足三种家 禽病毒的快速筛选检测需求，具有一定的应用价值。 关键词:多重检测; RT-LAMP 检测 禽流感病毒(Avian influenza virus , AIV) 血清 用型(5) 、禽流感 H5 亚型〔町、新城疫(7) 、猪蓝耳病(8) 、 亚型众多，抗原变异性强，宿主范围广泛，亚型之间 小反鱼兽疫病的系列 RT-LAMP 检测方法，现尝试 交叉保护率低，使得禽流感频繁暴发，成为养禽业 建立一个全新的分子生物学检测平台，力图找到一 的一大毁灭性疫病〔飞新城疫(Newcastle disease , 个适合现场的分子生物学快速检测技术。 M基因 ND)是由副粘病毒 I 型病毒(Newcastle disease vi- 是禽流感的保守基因，是分子生物学检测中的主要 , NDV) 引起的一类主要感染禽类的烈性传染 rus 靶基因〔1 〕;融合蛋白基因 (F 基因)是新城疫病毒的 病，俗称鸡瘟，是我国进出口重点防控的重大动物 重要免疫原蛋白基因∞，对新城疫的诊断具有重要 疾病(2) 。鸡传染性法氏囊病(infectious bursal dis 意义;VPl 基因是法氏囊病毒特异性的检测基因， eases ， IBD)又称鸡传染性腔上囊病，是由传染性法 对法氏囊的诊断具有重要意义阳。在建立以上三个 氏囊病病毒(infectious bursal diseases virus , IB- 疾病单重 RT-LAMP 检测方法基础上，我们将三个 DV) 引起的一种急性、具有免疫抑制性的烈性家禽