病毒RNA纯化试剂盒说明书及应用探究.docVIP

病毒RNA纯化试剂盒说明书 产品组成 病毒RNA纯化试剂盒 Cat. No. 5次样品 4001005 50次制备 4001050 核酸纯化柱 2 ml离心管 Carrier RNA Buffer L Buffer WA（浓缩液） Buffer WBR（浓缩液） Buffer TE 说明书 5个 5个 20 μl 2 ml 1.9 ml 1.5 ml 0.6 ml 1份 50个 50个 180 μl 18 ml 12 ml 9.5 ml 2 ml×2 1份 产品储存 Carrier RNA请置于-20℃贮存。 其他试剂与物品如果储存于室温（15~25℃），可在两年内保持使用性能无明显变化；如果将产品贮存于2~8℃，可延长产品的有效期至两年以上。 技术支持 杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：e-mail: technical@, 电话：400-0099-857。 产品介绍 本产品适合从100 μl新鲜的或者是冷冻贮藏的不含细胞的体液样品（包括血浆、血清、尿液、CSF及细胞培养上清）中分离纯化病毒RNA。用本试剂盒分离纯化的病毒核酸最高可检测到体液中500copies/ml浓度的RNA病毒。被溶解的体液中的病毒核酸结合到纯化柱上后，经两种洗涤液洗去除残留在纯化柱上PCR抑制物，病毒核酸最后用Buffer TE洗脱，即可用于RT-PCR反应。 用户需自备的试剂与物品 无水乙醇 1.5ml离心管（必须选用DNase-free RNase-free的1.5ml离心管） 移液器吸头（选用含有滤芯的DNase-free RNase-free移液器吸头） 一次性手套及防护用品纸巾 台式小量离心机（可配离心1.5ml离心管和2ml离心管的转子） 旋涡震荡器1）℃水浴至沉淀消失后再使用(注意：当室温低于20℃时Buffer L极易出现沉淀)。 2）如果离心机有制冷功能，请将温度设置到25℃。3）根据试剂瓶标签上的指示在Buffer WA和Buffer WB中加入无水乙醇，并在标签的方框中打勾作好“乙醇已加”的标记。 根据所需要制备的核酸样品数计算需要使用的Buffer L体积（00 μl Buffer L/管，注意由于加液过程可能存在误差，建议计算时增加300~500 μl Buffer L的体积），按每1ml Buffer L体积加入10 μl Carrier RNA的比例加入Carrier RNA，旋涡振荡数秒混匀。Carrier RNA全部加入到Buffer L中，则必须在12小时内用完试剂盒。 操作步骤 ： 尽量采用新鲜分离的或者冻融不超过一次的血清进行病毒RNA的分离纯化。反复冻融的血清将导致检出的敏感性降低，表现为CT值偏大或者假阴性。 使用冻融超过一次以上的血清进行病毒RNA分离时，应先将血清于6800rpm离心3分钟，吸取10 μl上清进行病毒RNA的分离；否则血清中因反复冻融所产生的冷凝蛋白可能在操作过程中堵塞纯化柱，导致病毒RNA分离失败。 1）在1.5ml离心管中加入00 μl 含Carrier RNA 的Buffer L，再加入10 μl 血清，旋涡振荡混合均匀，室温静置10分钟。 * 为避免阳性血清污染Buffer L而造成假阳性，应先加入Buffer L再加入待检血清。 * 为避免打开管盖时样品间的交叉污染，可低速离心数秒，使管盖上的溶液沉降到管底。 2）每管加入0 μl无水乙醇，温和地翻转离心管35次混合均匀。 * 为避免打开管盖时样品间的交叉污染，可低速离心数秒，使管盖上的溶液沉降到管底。 3）吸取步骤2）中的液加入到核酸纯化柱中（核酸纯化柱置于2ml 离心管中），盖上管盖，12000 rpm 离心30秒。 * 注意不要将溶液沾到到纯化柱管口的边缘上，以免后续的洗涤步骤不能洗净纯化柱。）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml 离心管中，在核酸纯化柱中加入500 μl Buffer WA, 盖上管盖，12000 rpm 离心30秒。* 滤液无需彻底弃尽，避免粘附在离心管管口的滤液对离心机的污染2ml 离心管在纸巾上倒扣拍击一次。* 确认在Buffer WA中已经加入无水乙醇。 ) 弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml 离心管中，在核酸纯化柱中加入600 μl Buffer WB, 盖上管盖，14000 rpm 离心1分钟。 * 确认在Buffer WB中已经加入无水乙醇。 * 如果离心机的离心速度达不到14000 rpm，则用最高速离心2分钟。 ) 弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml 离心管中，14000 rpm 离心1分钟。 * 如果离心机的离心速度达不到14000 rpm，则用最高速离心2分钟。 * 请勿省略该步骤，否则可能因所纯化的核酸中混有乙醇