第6章补体结合反应技术.docVIP

第六章 补体结合反应技术 （Complement fixation reaction technique） 概况 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂质和病毒等，与相应抗体结合后，抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能察觉，如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相应的抗原或抗体。这个反应就是补体结合反应。 补体结合反应是一种古老的血清学技术，Bordet和Gengou在1901年设计这一试验，由于有敏感性高和适应性广的优点，尽管操作繁杂，目前仍被有效地应用。 （一）补体及其作用特点 补体存在于哺乳动物血清中，各种动物比较，豚鼠血清中补体含量最高，成分较全，效价稳定，采取方便，故通常将豚鼠的全血清作为补体。56℃30min可使补体失去活性，称为“灭能”或“非动”。 补体的作用为能与抗原—抗体复合物结合，但不能与抗原单独结合，也不易与抗体单独结合；补体的作用没有特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合。它能与红细胞（抗原）和溶血素（抗体）的复合物结合，引起红细胞破坏（溶血），也能与细菌、病毒成分及其相应抗体的复合物结合。 （二）溶血反应 将红细胞多次注射于动物（如将绵羊红细胞多次免疫家兔）可使之产生相应的抗体（溶血 素），这种抗体与红细胞结合，若有补体存在时，则红细胞被溶解，这种现象称为溶血反应。红细胞和溶血素被称为溶血系统，常在补体结合反应中用作测定有无补体游离存在的指示剂。 （三）补体结合反应及其原理 可溶性抗原，如蛋白质、多糖、类脂、病毒等或者颗粒性抗原，与相应抗体结合后，其抗原抗体复合物可以结合补体，但这一反应肉眼不能觉察。如再加入红细胞和溶血素，即可根据是否出现溶血反应来判定反应系统中是否存在相对应的抗原和抗体。此反应即为补体结合反应。 补体结合反应中的抗体主要是IgG和IgM。 反应的原理在于补体本身没有特异性，能与任何抗原抗体复合物结合。以检查鼻疽病为例，先向试管中加入已知的抗原（鼻疽菌的浸出液），再加入被检马匹的血清（抗体）和豚鼠血清（补体），这三种成分称为反应系统或溶菌系统。如果该马是鼻疽病马，则血清中有抗鼻疽杆菌的抗体。抗原和抗体发生结合，吸附补体。如果该马没有鼻疽病，血清中没有抗鼻疽菌的抗体，则不能形成抗原抗体复合物，不能吸附补体，则补体游离存在。 由于许多抗原是非细胞性的，而且上述抗原、抗体和补体三种成分都是用生理盐水或缓冲盐水稀释的比较透明的液体，所以补体不论是否被结合，都不能直接看到，故无法判定。 因此，在反应系统的三种成分作用一定时间之后，再向其中添加指示系统—绵羊红细胞和特异性抗体溶血素。如果抗原和病马血清中抗体特异性结合，吸附补体，没有游离补体存在，加入指示系统，因无补体参加，不发生溶血，这种情况称为补体结合反应阳性，即该马患有鼻疽病；反之，则该马未患鼻疽病。 (四) 补体结合反应的特点 补体结合反应操作繁杂，且需十分细致，反应的各个因子的量必须有恰当的比例。特别是补体和溶血素的用量。补体的用量必须恰如其分，例如：抗原抗体呈特异性结合，吸附补体，本应不溶血，但因补体过多，多余部分转向溶血系统，发生溶血现象。又如抗原抗体为非特异性，抗原抗体不结合，不吸附补体，补体转向溶血系统，应完全溶血，但由于补体过少，不能全溶，影响结果判定。故补体量必须恰如其分。溶血素量也有一定影响，例如阴性血清，应完全溶血，但溶血素量少，溶血不全，可被误认为弱阳性。另外，这些因子的用量又与其活性有关：活性强，用量少；活性弱，用量多，故在本试验之前，必须精确测定溶血素效价、溶血系统补体价、溶菌系统补体价等，测定其活性以确定用量。 （五）补体结合反应的应用 补体结合反应是诊断人、畜传染病常用的血清学诊断方法之一。本法不仅可用于诊断传染病，如鼻疽、牛肺疫、马传染性贫血、乙型脑炎、布氏杆菌病、钩端螺旋体病、血锥虫病等，也可用于鉴定病原体，如对马流行性乙型脑炎病毒的鉴定和口蹄疫病毒的定型等。 经典补体结合反应（以马鼻疽补反为例） （一）预备试验 1．绵羊红细胞悬浮液的制备 通常用公绵羊红细胞，将绵羊血液采集于带有玻璃珠的无菌容器中，充分振摇，使脱去纤维，此时血液失去凝固性，称脱纤血。 亦可用阿氏液保存血液，阿氏液配方如下： 葡萄糖 24.60g 氯化钠 5.04g 柠檬酸钠（含2个分子结晶水） 9.60g 蒸馏水 1 200ml 溶液配好后，高压（10磅）灭菌10min，也可通过蔡氏滤器灭菌。溶液盛于瓶内，将绵羊血直接采入瓶