双重套式PCR方法在霍乱弧菌外环境监测中的应用.PDF

．论著． 双重套式PCR方法在霍乱弧菌外环境监测 中的应用 陈爱平 董新平徐海滨杨劲松严延生 郭维植王多春 阚飙 【摘要】 目的建立一种能够检测01群和0139群霍乱弧菌的套式聚合酶链反应方法，并应用 于外环境水体标本的监测。方法 根据GenBank发表的Ol群和0139群霍乱弧菌0抗原编码基因 Primer rfb的序列，运用DNAStarSelect软件各自设计6条引物，检测不同引物组合的特异性，建立双 重套式PCR方法同时检测0l群和0139群霍乱弧菌；并对该方法进行敏感度、特异度、重复性及现场 评价。通过比较套式PCR与常规PCR的DNA检出下限分析该方法的敏感度；对32份套式PCR阳 性的水体样本(Ol群11份，0139群2l份)进行重复性评价，挑选部分阳性扩增产物进行测序，分析 其与相应基因序列的一致性。结果 建立的检测0l群和0139群霍乱弧菌的双重套式PCR体系， 根据其扩增的片段大小能够区分Ol群和0139群霍乱弧菌，而对其他弧菌DNA样品都未见特异性 扩增；敏感度比常规PCR高15000倍，且在多引物或者多模板共存于一个反应管的试验条件下，不会 对敏感度产生干扰；32份套式PCR阳性的水样标本，经2次或3次套式PCR试验，结果显示该体系 具有较好的重复性和一致性，阴性水样均无任何扩增产物，说明所用引物的特异性较好；序列分析表 明扩增产物仅同霍乱弧菌相应的基因序列有100％的一致性。结论本检测相应霍乱弧菌的双重套 式PCR方法，具有灵敏、特异、快速、适合基层实验室的特点，可用于监测外环境水体中霍乱弧菌的存 在及消长情况。 【关键词】霍乱弧菌；聚合酶链反应；环境监测 A nestedPCR ofvibriocholeraeandits OHenvironmental duplex assaydetecang appHcatioH CHEN Wei· specim咄 Ai-ping‘，DONGXin-ping，XUHai·bin，YANGJin-song，MⅣYan—sheng，GUO DiseaseControland zhi．WANGDuo．chun．删VBiaa‘FujianCenter加r Prevention。F档hou35000J。China author：CHEN corn, Corresponding Ai-ping．Email：zhyjcap@yahoa Toestablisha nestedPcR whichis for 【Abstract】Objecave duplex assaysystem capable 01and0139 ofVibriocholerae iS toenviFonmental detecting groups simultaneously．andapplicable specimensfromroutinecholerasurveillance．MethodsBasedonnucleicacidsequencesavailablein setsof wele PrimerSelectof therib that GenBank，sixprimersdesignedby programDNAStar，targetinggene encodesthe0 of0land0139 ofseveral antigens V．eholerae．respectively．Thespeciticity primer combinationsWastested．A nestedPCR for