蛹虫草萃取物抗猪蓝耳病病毒PRRS之研究前言试验方法猪生殖与呼吸.PDF

蛹蟲草萃取物抗蛹蟲草萃取物抗 豬藍耳病病毒豬藍耳病病毒PRRS之研究之研究 蛹蟲草萃取物抗蛹蟲草萃取物抗 豬藍耳病病毒豬藍耳病病毒 之研究之研究 前言前言 前言前言 PRRSV 為正向單股 RNA 病毒，在自然環境下病毒基因能隨機突變並具有 重組 (intragenic recombination)的現象產生 ，雖然目前已有 PRRSV 商品化疫 苗，但由於疫苗的保護效力不佳 ，使得 PRRSV至今仍在各地肆虐。蛹蟲草為中 國傳統的珍貴藥用真菌 ，其二次代謝物蟲草素- (Cordycepin) 具有抗病毒活性 ， 它是一種重要的核苷抗代謝物，結構與腺苷相似，替代腺苷參予了病毒代謝過 程，抑制 mRNA腺嘌呤尾部延長 ，蟲草素 5’-三磷酸連至 mRNA 3’ 端，因缺 少 3’-OH 而導致了 mRNA 無法延伸 ，使得 mRNA 無法成熟 ，所以能抑制病 毒中 mRNA 後轉譯作用 ，是嘌呤再生合成之回饋抑制劑。研究發現，蟲草素有 抑制新城雞瘟病毒 mRNA的合成 (Weiss and Bratt, 1975) 、抑制 C 肝病毒 RNA 模板的複製 (King et al., 2002) 、抗 HIV-I 型病毒反轉錄酵素合成酶活性 (Wang et al., 2012) 。 實驗方法實驗方法 實驗方法實驗方法 豬生殖與呼吸綜合症病毒豬生殖與呼吸綜合症病毒 (PRRSV) 力價測定力價測定 豬生殖與呼吸綜合症病毒豬生殖與呼吸綜合症病毒 力價測定力價測定 3 將豬生殖與呼吸綜合症病毒培養於 96 孔盤中 (5×10 cell / well) ，於 37 ℃、5% CO 培養箱中培養 ，待細胞貼附於培養盤上，形成 60% 滿細胞正好會 2 形成單層化，移除培養液，即可進行病毒效價測定。首先將待測豬生殖與呼吸綜 合症病毒株以培養液製作 10倍連續稀釋 ，使病毒稀釋為 10-1 -10-8 濃度 (100µl / well) ，每個稀釋倍數進行6重複 ，培養於37℃、5% CO 恆溫培養箱 ，三天後已 2 倒立顯微鏡觀察細胞病變效應 (cytopathic effect, CPE) 現象 ，即細胞在感染病毒 後產生剝落 、變圓、萎縮等現象。以 Reed-Muench 法計算細胞所產生的 CPE ， 藉此可算出病毒的 TCID50 (tissue culture infection dosage) (能讓 50% 培養之細 67 胞產生 CPE的病毒量 ) 。下列公式為病毒效價之計算： 先計算出比例距離 (proportionate distance ，PD) (高稀釋倍數次方 －低稀釋倍數次方) × (感染率高於 50%的百分比 －50) 感染率高於( 50%的百分比 －感染率低於 50%的百分比 ) 再計算 50% 終點稀釋度 = log (感染率高於 50%的稀釋濃度 ) －PD TCID50 = 1050% 終點稀釋度 細胞形態變化觀察細胞形態變化觀察 細胞形態變化觀察細胞形態變化觀察 蛹蟲草萃取物 (CMHW) 對於非洲綠猴腎臟細胞株 (Marc-145) 與豬肺泡巨 噬細胞 (porcine alveolar macrophages, PAM) 形態變化觀察。以血球計數盤計數 後將 2×106 細胞培養於 6 cm petri dish 使細胞貼附 ，實驗組加入蛹蟲草萃取物 (CMHW) ，以 DMEM 和 RPMI-1640 液態培養基調整濃度為含 1 、4 、7 、10 µg/mL cord