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STR-微卫星分析 2014.9 微卫星分析简介 基本概念 STR分析的原理 STR分析的实验过程 微卫星标记： 微卫星标记是均匀分布于真核生物基因组中的简单重复序列，由2～6个核苷酸的串联重复片段构成。 每个微卫星DNA 都由核心序列和侧翼序列组成。侧翼DNA 序列位于核心序列的两端，为保守的特异单拷贝序列，能使微卫星特异地定位于染色体常染色质区的特定部位。 基本概念 1gggatcacccctcacaactactacgccagtcttggtgtcattcctgtctgtccgccttagctcgcatttctttgtgtgtgggtgggttTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGtatgtgtgtgctctgagacatatgatgccaggacattcttgaggccgcagcttaaagactcaacccttctgcccaagtagacaatcatactgatccc 213 Target region (short tandem repeat) 7 repeats 8 repeats 9 repeats 10 repeats 11 repeats 12 repeats 13 repeats 根据微卫星DNA两端序列的保守性，设计一对特异性的引物，利用荧光标记的PCR引物对微卫星位点进行扩增，然后通过高分辨率的凝胶电泳对扩增片段进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片段的长度以检测分析微卫星序列的多态性。 STR分析的原理 测序仪电泳过程： 带荧光分子的DNA片段在凝胶中从阴极向阳极迁移，按片段长度大小排列，当迁移到阳极端的激光扫描仪的扫描窗口，荧光染料受到激发，发出一定波长的光。 每一个带荧光染料的DNA片段的电泳轨迹按各自通过激光扫描窗口的实际时间被记录下来，以荧光吸收峰来表示每一个片段。片段小，出峰早。 STR分析的原理 分子量内标的作用：已知长度的片段作分子量标准，可以得到长度对迁移时间的标准曲线。 测定出未知样品的迁移时间，与标准曲线相比较后，计算出未知片段长度，这就是片段分析（GeneScan）。 STR分析的原理 STR分析的实验过程 1、STR检测服务订单：其中要注明样品的数量、类型、物种来源、染色体倍数、是否提供内参，以及检测位点的信息和标记荧光。 2、要进行STR检测的样品：包括PCR产物、基因组DNA或其他血液样本和组织样本。 接到客户订单 客户提供 订单确认 1、分析客户需要检测的STR位点，根据客户STR分型的要求给出实验所需的时间和价格。 2、将实验方案，包括荧光标记、内标、引物序列做成PDF格式发送给客户确定订单。 基因组提取：血液样本20元/样；组织样本50元/样？ PCR预实验：每个STR位点100元（包括引物合成及PCR反应的试剂耗材费用） 荧光引物：每条150元？ 正式实验：每个样品每个位点1.3元（再加上内标的费用）？ 单独跑板子：300元/板 价格 1、PCR产物和基因组DNA可以直接进行STR-PCR。 2、植物组织：鲜的植物组织100 mg或干重30 mg，剪碎之后加入液氮充分研磨 注：提取样品一般选用代谢产物少、细胞数量相对较多的植物组织如健康嫩叶、幼芽等。通常情况下，在采集前将目标植物置于暗处1-2天，可有效地减少代谢物的产生。 3、动物组织：（组织用量应少于10 mg）应事先打碎处理成细胞悬液（匀浆器匀浆或者加入液氮研磨），然后离心去上清。 4、细胞：贴壁细胞应先处理成细胞悬液，然后离心去上清；悬浮细胞则直接离心去上清。细胞数量为1~5×106 。 5、血液： 如果血液（已加入抗凝剂）体积小于200 μl，可以加缓冲液补足200 μl使用； 如果血液体积大于200 μl，则需要在样品中加入三倍体积的红细胞裂解液，混匀放置5 min，离心去上清；如果处理血样为禽类、鸟类、两栖类或更低级的生物的抗凝血液，其红细胞为有核细胞，因此处理量为5-20 μl，再加入缓冲液补足200 μl使用。 6、细菌：取1-5 ml细菌培养液离心去上清。注：对于较难破壁的革兰氏阳性菌，需要加入溶菌酶处理。 7、酵母菌：取酵母细胞（不超过5×107细胞），离心去上清；再用酶解法去除酵母细胞壁。 样品处理 引物设计：用SSRHunter软件分析STR位点，根据侧翼的保守序列用primer premier 5软件设计引物。 荧光标记的选择：ROX、 HEX、 FAM等根据客户的要求确定使用哪一种或哪几种做为荧光标记。 内标 实验设计 荧光标记 发射波长 代替物 发射波长 6-FAM 518 TET 536 HEX 556 VIC 554 TAMRA 580 CY3 568 ROX 602 CY5 666 NED 电泳检测客户提供的DNA的质量（浓度和质量） 用不加