分子标记辅助选择实验方法.docVIP

分子标记筛选实验 DNA提取的实验仪器与耗材准备：水浴锅，高速冷冻离心机，小型离心机，预冷的异丙醇，1.5ml的灭菌eppondorf管，50 ml的灭菌离心管，70%的酒精，5M的KAc混合液，研钵，液氮，SDS抽取液，1M Tri-HCl (pH 8.0)，0.5M EDTA (pH 8.0)，TE (pH 8.0)( 相关试剂配法见《分子克隆》，金冬雁等，1996） 1.DNA小量提取法（SDS小量提取法） F2群体DNA采用SDS小量提取法，步骤如下： 1. 取新鲜水稻样本叶片2cm左右于1.5 eppondorf管中，加入液氮，用电钻磨碎。 2. 每管磨碎的水稻叶片中加入700ul已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴30min。 3. 加入200ul 预冷的5MKAc混合液，颠倒充分混匀，冰浴30min后，于40C 10000转离心4min，吸取上层液到另一准备好的1.5ml eppondorf管中。 4. 加入等体积预冷的异丙醇，置于-200C 30min后，40C 10000转离心4min。 5. 弃上清，加入70% 乙醇清洗，上下颠倒混匀，小型离心机快速离心弃上清，倒扣晾干（注：晾干不宜太久，反止DNA难溶）。 6. 将晾干的DNA溶于100ul TE溶液中， 40C保存备用。 2．DNA大量提取法（SDS大量提取法） 亲本DNA和突变体DNA池、正常株DNA池采取SDS大量提取法，步骤如下： 1.取每个水稻新鲜样本叶片1g，放入10ml离心管，加入液氮，用电钻磨碎。 2.加入5ml已预热至650C 的SDS抽取液，迅速搅匀后置于650C水浴20min。 3.水浴20min后加入1 ml 5MKAc混合液，上下颠倒充分混匀，冰浴20min，冰浴期间要将离心管上下颠倒数次。 4.加入等体积的氯仿，室温下以3000（10000 rmp）的速度离心 3min，吸取上清于另一准备好的50 ml离心管中。 5.加入等体积的异丙醇，轻轻摇晃，可以看见DNA絮状沉淀。 6.用玻棒挑出DNA絮状物，用75%乙醇清洗两次，将乙醇到掉，晾干。 7.将晾干的DNA溶于500ul TE溶液中， 40C保存备用。 3．PCR扩增体系与反应条件 3.1 PCR 反应体系 终浓度 Primer pair (4uM) 2ul 0.4 uM 10×buffer 2ul 1×buffer Mg2+(25mM) 2ul 2.5uM dNTPs(10mM) 0.3ul 133ul Taq酶（4u/ul）,4min 94℃,45s 55℃（因具体引物而定）, 45s (32个循环) 72，45s 72℃,10min→ 4℃,保存 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验仪器与试剂：小型电泳槽及配套大小玻璃板，夹条、梳子、黑色的长夹子（full-length clamps））（6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶）, 10分钟）每100ml 10%的乙醇加500μl冰醋酸20%硝酸银溶液1ml 20%的硝酸银100ml固定液加入显影液（每100ml 3%的NaOH加500μl甲醛），在水平摇床上显色10左右。