棉花病毒互作转录组测序方案(修改版).doc

病毒与棉花互作转录组项目方案 利用转录组测序研究病毒侵染对棉花转录组的影响 一、研究背景 棉花是锦葵科棉花属植物，原产于亚热带，是我国主要的农作物。棉花病害是影响棉花产量的重要因素，病毒侵染棉花后的致病机理对于病毒的防治以及棉花抗病品种的杂交优化非常重要。但棉花目前没有已发表的基因组数据，为相关基因的研究带来一定的困难。 转录组是连接基因组遗传信息与生物功能的必然纽带，转录组研究已经成为揭示生物生长发育调控、逆境胁迫适应、生物进化规律、疾病发生发展以及基因调控等问题的最佳研究手段。 转录组测序(Transcriptome sequencing)可全面快速地获得某一物种特定细胞或组织在某一状态下的几乎所有的转录本及基因序列，可以用于研究基因结构和基因功能、可变剪接和新转录本预测等。随着测序成本的不断降低和测序通量的飞跃提升，第二代测序技术凭借高准确性、高通量、高灵敏 度和低运行成本等突出优势逐渐成为解决生物学问题不可或缺的手段。 二、研究目标 利用转录组测序找出病毒感染以后棉花转录组的变化，分析病毒感染可能的分子机制和相关的细胞通路等，为病毒的防治和棉花抗病品种的育种提供参考。 三、方案设计 技术路线 1 取样选择 不同病毒侵染时间棉花植株的子叶： （病毒或其他病原菌感染的实验多数的采样时间也是这样的，取样时间按照相关经验选择即可，并且目前是预实验阶段，建议初步分析以后再适当调整取样时间） 在样品的取样方面，如果单个样品的RNA提取量够用，我们不建议混样。 从生物学重复的角度来说，混样也可以降低部分生物学差异，解决部分生物学重复的问题。 但一个样品包含多重的数据可能为分析带来不便，也会掩盖一些重要的突变或者表达差异（举例来说，如果一个重要的SNP在一个样品中的突变率为1%，混样后突变率分析出来可能就变成了0.33%，分析的时候就发现不了；基因的表达水平也有可能出现类似情况）。 因此，3株子叶混合的方案需要综合实验目的考虑决定，我们只是从技术上提供参考。 2 Total RNA提取 2.1 RNA提取 高质量total RNA，可参照实验经验选取合适提取方法，样本要求如下： 样品总量：≥3ug 样品浓度：≥50ng/ul 植物RNA样本完整性：RIN6.5； 2.2 RNA样品检测 采用4种方法对RNA样品进行检测：琼脂糖凝胶电泳分析RNA降解程度以及是否有污染；Nanodrop检测RNA的纯度（OD260/280比值）；Qubit对RNA浓度进行精确定量；Agilent 2100精确检测RNA的完整性。 3 建库上机 3.1 转录组文库构建 利用NEBNext® Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module富集mRNA，使用NEBNext® mRNA Library Prep Master Mix Set for Illumina构建普通转录组文库，插入片段大小为200bp，并对文库质量进行检验。 3.4 上机测序 测序策略：Hiseq2500，PE125 数据量： 6G clean data 4 信息分析 4.1 首先按照统一标准对原始数据进行质量评估，去除接头reads、低质量reads等，并给出统计表； （示意图如下） 4.5 SNP、Indel分析、SSR 鉴定不同实验组转录组的SNP、Indel、SSR位点等，分析潜在的病毒编辑位点； 4.2 通过与病毒基因组的比对分析，从测序数据中去除病毒序列用作棉花转录组序列； 4.3 转录组拼接 由于棉花没有参考基因组，首先用Trinity将棉花测序序列拼接成一个转录组，以此作为后续分析的参考序列； 4.4 基因功能注释、新基因预测 对Trinity拼接得到的转录组信息进行分析，注释各个unigene的功能（示意图如下），将不能注释的unigene进行预测；