酵母单杂交1.pptVIP

分子生物学技术 1. cDNA文库 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。 构建步骤： 1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素 文库中筛选目的基因 3.1 酵母双杂交体系?（Yeast tow-hybrid system）? 双杂交系统组成部分: 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株 表达诱饵蛋白的载体，诱饵即是我们感兴趣的蛋白，它和DNA结合结构域融合. 表达靶蛋白的载体，靶蛋白即是我们要寻找的可以与诱饵相互作用的蛋白，靶蛋白可以是一个已知的蛋白，也可以是cDNA文库编码的蛋白.同诱饵相似，靶蛋白和转录激活结构域融合. 一个或多个报告基因(lacz his3 leu) 将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录）的阳性菌落。 酵母双杂交的原理 酵母杂交出现假阳性的原因： 1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖 。 酵母双杂交系统的应用： 发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作用（细胞内） 检测已知蛋白质之间的相互作用 确定末知蛋白之间的相互作用 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理 酵母双杂交系统的优点 用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确，不受外界影响，易于操作; 所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋白质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用； 运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能区，可以大到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以小到一个约22个氨基酸的多肽。 酵母双杂交系统的局限性 该系统要求Bait蛋白能够被稳定地表达成融合蛋白，且该融合蛋白必须能被转运到细胞核内，因而不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作用的研究就不宜用该系统; 如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译后加工才能相互作用，则该系统也不适用，因为酵母的后加工系统与哺乳动物细胞后加工系统不尽相同. 三杂交系统 酵母单杂交 酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相互作用。 酵母单杂交系统组成 (1)将文库基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒； (2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura- （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ） 基本流程: 构建含靶结合序列的报告载体 转化酵母细胞 检测基础报告表达 筛选AD融合文库 排除假阳性筛选出阳性克隆 扩增阳性克隆，以证实DNA一蛋白质结合活性 进一步分析: 酵母单杂交技术的应用 (1)确定已知DNA一蛋白质之间是否存在相互作用; (2)分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因; (3)定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。 （4）正向与反向单杂交体系的结合还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸 酵母单杂交体系的主要优点: 通过筛选DNA文库可直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列，而无需分离、纯化蛋白。 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。 酵母单杂交体系的缺点: 假阳性结果 由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录 假阴性结果 如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细胞核内，以及融合的Ga14 AD封闭了蛋白上与DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力 分子生物学技术小测 PCR的原理。举例说出两种以PCR技术为基础的衍生技术。 试述RNAi技术的原理和应用。 分子标记的定义是什么？举例说出2-3种分子标记技术。 RACE技术。 基因芯片技术原理及应用。 * 2、反转录生成cDNA: 反转录酶，oligo(dT) ,R6 3