乙肝病毒检测及分析趋势.pptVIP

乙肝病毒检测 病毒鉴定方法 一、分离培养方法 二、快速诊断方法 1、光学显微镜检查 病毒包涵体及某些大病毒颗粒的检查 2、电子显微镜的检查 电镜直接检查 免疫电镜检查 3、血清学检查 4、病毒基因组检查 核酸杂交和聚合酶链反应 乙肝病毒检测 一、乙肝五项（两对半） 二、乙肝病毒核酸定量检测 HBV抗原抗体系统检测临床意义 HBsAg 抗-HBs HBeAg 抗-HBe 抗-HBc 临床意义 IgM IgG + - - - - - 感染或无症状携带者 + - + - + - 急性或慢性乙型肝炎（传染性强） （大三阳） + - - + - + 急性肝炎趋向恢复 （小三阳） - + - + - + 既往感染恢复期 - + - + - - 既往感染恢复期 - - - - - + 既往感染 - + - - - - 既往感染或接种疫苗 - - - - - - 未感染，无免疫力 二、乙肝病毒核酸定量检测 1.检测原理 利用荧光PCR技术，以HBV基因组中相对保守区为靶区域，设计特异引物及荧光探针，通过PCR对DNA进行快速定量检测。 荧光探针TaqMan 探针实时荧光 PCR 技术。在 PCR 反应过程中，同时利用 Taq 酶的 5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan 探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM 荧光检测乙型肝炎病毒JOE/RED610 nm 波长通道检测内参。 PCR分四个阶段 如何定量？ Ct值的概念 Ct值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的循环次数。 定量原理 确定初始模板的浓度 初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量 荧光化学 SYBR Green 1 TaqMan TaqMan SYBR Green I 工作原理 。 SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光 G T T T G G C C C C C C C A A A G G G A C T T G A T A G C A T C G T A A G T T T T T T G G G G C C C C C C C C A A A A A T A C C G G G G T T A C G A A C G G T A A T 未结合SYBR Green 1 dye 变性: 无荧光信号 2.所用试剂 组分名称 规格 数量 主要成分 核酸提取试剂 DNA提取液I 4.5ml/瓶 2 DNA提取液 质控品及阳性定量参考品 阴性质控品 250ul/管 1 HBV阴性血清 强阳性质控品 250ul/管 1 灭活HBV阳性血清 临界阳性质控品 250ul/管 1 灭活HBV阳性血清 HBV定量参考品（2.0X106IU/ml） 250ul/管 1 灭活HBV阳性血清 HBV定量参考品（2.0X105IU/ml） 250ul/管 1 灭活HBV阳性血清 HBV定量参考品（2.0X104IU/ml） 250ul/管 1 灭活HBV阳性血清 HBV定量参考品（2.0X103IU/ml） 250ul/管 1 灭活HBV阳性血清 PCR检测试剂 HBV-内标溶液 100ul/管 1 内标质粒及稳定剂 HBV-PCR反应管 1人一份/管 20 引物、探针、taq酶等 3、实验步骤 1.DNA提取 将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品进行同步处理。 1.1 取200 μL样品，加入450 μL DNA提取液I和4 μL内标溶液，用振荡器剧烈震荡摇匀15秒，瞬时离心数秒，100℃处理10分钟 1.2 12000rpm离心5分钟，备用 2.PCR试剂准备 直接使用HBV-PCR反应管 3. 加样 HBV-PCR反应管分别加入将待测样本、阳性定量参考品、阴性质控品、HBV强阳性质控品、 HBV临界质控品上清20 μL。盖紧管盖，8000rpm离心数秒后扩增 4.PCR扩增 对各标本进行标记 反应条件： 93℃ 2分钟 93℃ 45秒→55℃ 60秒→10个循环 93℃ 30秒→45℃ 60秒→30个循环 FAM通道检测HBV核酸，VIC通道检测内标 4.结果判定 1 如果在FAM检测通道检测扩增曲线无明显对数期或Ct值等于30，VIC检测通道扩增曲线有明显对数期，则为阴性或小于检测灵敏度 2 FAM检测通道扩增曲线有明显对数期且Ct值小于30 按以下