羊膜间充质干细胞原代分离培养标准操作规程.docVIP

1 目的 范围 职责 4.1 材料 健康胎盘羊膜组织 仪器设备 超净工作台、倒置显微镜、CO2培养箱、电动移液枪、cm玻璃培养皿入洁净区之前用抑菌洗手液洗手，用75%酒精擦拭消毒双手培养皿℃，250r/min恒温气浴摇床中消化30min，每10min取出用手剧烈摇晃。 4.4.8将消化好的组织块依次转移至三个装mLPBS一次性储液瓶中，盖好盖子用手剧烈摇晃，漂洗次。4.4.9将漂洗好的组织块转移至100m烧杯中剪1mm3大小 4.4.10将剪碎的转至中加倍组织体积Ⅰ型胶原酶放37℃，250/min恒温摇床中消化h ，直至组织块完全。 取出消化好的组织，，目筛网滤到4 支 50m离心管中，配平200g/min离心5 min。 4.去上清mL完全培养基混匀后转移到2支mL离心 管中，配平200g/min离心5 min1×105cell/mL，用10mL一次性移液管接种10mL的细胞悬液至10cm的培养皿中，每皿添加100uL的1ug/mL EGF。十字摇晃培养皿5次，使细胞悬液均匀分布于培养皿中。 4.4.14在培养皿盖上方做好标记（条形码、代数、批次、操作人、日期），转移至5%CO2、37℃、饱和湿度为95%的细胞培养箱中培养。 4.4.15 48h后，用巴氏吸管吸掉皿内培养基，每皿加入10mL PBS清洗，重复2次。 4.4.16用10mL一次性移液管接种10mL的细胞悬液至10