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CTC检测技术总结美国Affymetrix与Cytelligen公司正在联合开发的差减富集 (SE)-iFISH-RNA FISH整合技术平台1.流式荧光检测仪——Luminex 100?多功能流式点阵仪流式荧光技术，是基于美国Luminex公司研制的多功能流式点阵仪（Luminex 100?）开发的高速度、高通量、并行检测的生物技术平台。它有机地整和了编码微球（color-coded beads）、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了其无与伦比的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学研究中的一大热点。流式荧光技术原理：该技术的核心是把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）用荧光染色的方法进行编码（微球的颜色是通过两种荧光染料染色得到的，调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球），然后将每种颜色的微球（或称为荧光编码微球）共价交联上针对特定检测物的探针、抗原或抗体。应用时，先把针对不同检测物的编码微球混合，再加入微量待检样本，在悬液中靶分子与微球表面交联的分子进行特异性地结合，在一个反应孔内可以同时完成多达100种不同的生物学反应。最后用Luminex?100进行分析，仪器通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。因为分子杂交或免疫反应是在悬浮溶液中进行，检测速度极快，而且可以在一个微量液态反应体系中同时检测多达100个指标。本课题基于Luminex?100激光流式分析仪平台，建立可以同时检测乳腺癌患者外周血中8种循环肿瘤细胞基因(包括hMAM、HER2、CK-19、SBEM、EPG2、hTERT、β-HCG和B305D)表达水平的悬浮阵列方法，以探讨多基因联合检测在乳腺癌早期复发转移诊断中的应用价值。2. 免疫磁珠分离细胞（MPC-Ⅰ型磁性细胞分离器MiltenyiBiotec，德国）传统细胞分离的方法有速度等密度沉降、等动力梯度沉降、差式沉降、离心洗提、双水相离和流式细胞仪等。与这些方法相比,免疫磁珠分离细胞具有如下优点:(1)可使目标细胞(target cell)直接从原料液如血液、骨髓、组织匀浆、培养液中分离出来,具有简便、快速的特点;(2)和离心、过滤等方法相比,细胞在磁性分离时受到的剪切力小,可避免细胞的失活;(3)具有很高的选择性;(4)外加磁场不会对原料液中的离子和带电溶质的运动产生影响;(5)仪器设备简单,操作费用低。自1995年首次报道磁性激活细胞分选(magnetic actived cell sorting，MACS)技术的应用以来，许多研究表明它可从恶性肿瘤患者的外周血中分离出单个肿瘤细胞。该技术是一种理想的分离靶细胞的分选方法，它将抗原抗体反应的高度特异性和磁珠的富集分离作用相结合具备固相化试剂特有的优点以及免疫学反应的专一性，使其在临床医学诊断上具有广阔的应用前景。其基本原理在于用单抗与磁性微珠结合形成免疫磁珠，再与靶细胞上的抗原结合成靶细胞抗原-抗体-磁珠复合物，由于该复合物具有磁响应性，所以在外加磁场的作用下能向一定的方向移动，这样靶细胞就能同其他细胞分离开来。它可对肿瘤患者血中的肿瘤细胞进行富集、分离，结合免疫细胞化学技术能在106-107个单核细胞中分离检测出一个肿瘤细胞，可直观计数癌细胞并将假阳性降低，同时分离的细胞具有良好生物学活性，且具有较高的敏感性。3.基于免疫磁性分离原理发展起来的CellSearch系统是一种半自动化的CTC检测仪器，由Veridex公司(强生公司子公司)开发，只需应用7．5 ml血液样本，即可从400多亿的血细胞中检测到一个CTC，敏感性较高。CellSearch系统的原理是上皮细胞来源的肿瘤细胞表面其上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesionmolecule，EpCAM)阳性，而血液细胞不表达EpCAM，依据此特点，将EpCAM抗体包被于磁珠表面，便可将CTC分离出来。CellSearch系统的基本流程是:先使用EpCAM抗体磁珠对上皮细胞进行富集，然后将细胞固定，用DAPI荧光核染料、CD45荧光抗体和CK8、CK18以及CK19荧光抗体标记细胞，再用半自动四色荧光显微镜Cell Spotter Analyzer进行分析，检测CK阳性、CD45阴性的上皮细胞，此即为CTC。CellSearch系统已被美国FDA批准应用于临床，目前主要应用于预测转移性乳腺癌、结直肠癌或前列腺癌的无病生存期和总生存期。临床应用结果表明，通过CellSearch系统检测CTC是传统医学影像学的有益补充，可借此有效评估患者的预后以及判断当前治疗方案的有效性。该方法简便、易行，而且可以对同一