2011级硕士研究生细胞培养与细胞操作重点.doc

1.细胞培养的概念 指从体内取出组织、细胞制成单个细胞悬液在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定的营养条件下，使其生存和生长，并维持其结构和功能特性，继续存活与增殖。培养过程中细胞不再形成组织。也可用已建系的细胞株复苏后继续培养，多是癌细胞。 目的：进行后续的生命科学研究—细胞操作 2.利用细胞培养技术进行生命科学研究的优点 1.研究的对象是活的细胞：在实验过程中，根据要求可始终保持细胞的活力，并可长时期的监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况。2.研究的条件可以人为控制：根据需要人为控制实验条件，方便观察与分析。3.研究的样本，可以达到均一性：通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的细胞； 实验条件均一。4.研究的内容便于观察、检测和记录。5.研究的范围比较广泛：1.多种学科均可利用细胞培养进行研究。2.可供实验的组织来源众多。6.研究的费用相对较经济：细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的样本。 3.试述影响体外培养细胞生长的各种因素。 （一）无毒无污染细胞培养环境：离体细胞缺乏防御能力，在有污染物和毒性物质的环境中生存可造成细胞生物学特性改变，甚至中毒死亡。（二）恒定的生长温度：组织和细胞培养的最适温度为35～37℃，培养细胞对低温的耐受力比对高温强。（三）合适的气体环境：开放培养时一般把细胞置于95%空气加5% CO2混合气体环境中（四）pH缓冲系统：培养环境需保持pH值恒定，大多数细胞的适宜pH值为7.2～7.4。（五）理想的渗透压：细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。（六）湿度和光：开放培养相对湿度控制在95%以上。细胞培养需避光。（七）其他因素：放射线、机械振动、接触橡胶用品、细胞接种密度的大小都会对细胞产生影响，培养细胞、培养液或其它培养试剂应放在固定的位置，收集细胞时离心速度不宜过大，细胞接种密度对细胞的生长也有影响。 4．细胞培养过程中常见的污染来源和污染类型有哪些？叙述各污染类型的特征。 （一）不洁净空气；（二）消毒不彻底；（三）操作不当；（四）不洁组织标本；（五）使用污染血清 （一）细菌污染的特征 1.多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，2.常见污染细菌：大肠埃希菌、假单孢菌、白色葡萄球菌、枯草杆菌等，3.培养液变混浊，pH降低，颜色变黄，4.由于细菌增殖迅速，发生污染48h以内就很明显，细菌污染易发现 （二）真菌污染的特征 1.较常见，炎热潮湿的季节多发，2.真菌种类繁多：白念色珠菌、酵母菌等，3.培养液变化：呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见，4.镜下观察：丝状、管状或树枝状菌丝，纵横交错穿行于细胞之间，5.真菌生长迅速，短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞，真菌污染不难发现 （三）病毒污染的特征 1.病毒寄生有种属特异性，污染的概率相对其他微生物较小，2.病毒颗粒微小，污染难于发现，一般的实验室都没有能力检查，3.以前病毒的形式整合在细胞染色体上，或以质粒形式存在于胞质中，随细胞分裂传到子代细胞，导致细胞发生变异、转化，形成异倍体细胞系，4.潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题，5.还会对进行某种未知病毒分离鉴定造成干扰 （四）支原体污染的特征 1.最常见，培养液中加入的血清通常是支原体污染的来源，2.支原体：直径0.2～2μm，无细胞壁，形态多样，一般过滤除菌无法去除，3.适于偏碱条件下（pH7.6～8.0）生存，对酸耐受性差，对热敏感，对青霉素抗药，4.培养基变化：pH不变，培养液不混浊，培养的细胞形态无明显变化，5.影响：DNA合成、代谢减慢、生长抑制 （五）细胞交叉污染 1.有些变化较轻微、不易察觉，2.严重时，污染的细胞优势生长，培养的目的细胞生长受抑，最终死亡，3.目前世界上已有几十种细胞都被Hela细胞所污染，许多实验宣告无效 （六）化学和物理性污染 1.最常见的化学性污染：玻璃制品清洗残留的变性剂、肥皂、未纯化的试剂、水、血清、生长辅助因子，2.培养环境中的物理因素：放射线、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响，3.一般来说，这两种污染较少发生，在操作过程中只要细心，很容易避免 5．细胞培养过程中，微生物污染的预防措施有哪些？ （一）器皿准备中的预防 1.细胞培养所用器材清洗、消毒要彻底，2.各种溶液灭菌除菌要仔细，无菌试验阴性后才能使用，3.操作室及剩余的无菌器材定期清洁消毒灭菌，4.器皿的运输、贮存过程中，严格操作，谨防污染 （二）操作前的预防 1.事先要严格检查器材、溶液和培养物，不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内，更不能随便使用，2.进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5min，穿隔离衣、戴无菌鞋帽、口罩和手套，3.操作前提前30min启动超净台的紫外灯消毒，4.定期清洗