几种逆境相关生理指标的测定.doc

逆境生理指标的测定 姓名：专业：生物化学与分子生物学学号：200808日期：2009..10 成绩： 一、正常条件与盐胁迫下玉米中超氧物歧化酶活性的测定一、实验目的：测定正常条件与盐胁迫下玉米保护酶SOD的活性， 并观察其变化趋势。 超氧物歧化酶催化下列反应： 2 +2H+ → H2O2 + O2 反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。 本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有可被氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生 ， 可将氮蓝四唑还原为蓝色的化合物，蓝色化合物在560nm处有最大吸收，而SOD可清除 从而抑制了蓝色化合物的形成。因此光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 三、实验材料、仪器与器皿： 1. 实验材料：1mol/LNaCl处理24h的三叶一心玉米幼苗，未处理的三叶一心玉米幼苗 2. 实验仪器：高速低温台式离心机；分光光度计；试管 3. 实验试剂：0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液 750μmol/L氮蓝四唑溶液100μmol/L EDTA-Na2溶液 20μmol/L核黄素溶液。 四、实验方法 　　1、酶液提取 取一定部位的植物叶片0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。于10000rpm下离心10分钟，上清液即为SOD粗提液。 2、显色反应 取5ml试管（或指形管，要求透明度好）7支，3支试管为测定管，另4支为对照管，按表1加入各溶液。 混匀后将1支对照管置暗处，其他各管置于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时反应时间可以缩短，温度低时反应时间可适当延长(温度范围30~37℃)。表1 各溶液加入量 试 剂（酶） 用量(ml) 终浓度（比色时） 0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶液 蒸馏水 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.1 0.2 13mmol 75μmol 10μmol 2.0μmol 对照管加缓冲液代替酶液 总体积 3.0 3、SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的对照管作空白，在560nm下分别测定其它各管的光密度值，SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性。 SOD总活性 = 单位：酶单位/g鲜重表示； Ack―照光对照管的光密度值； AE—样品管的光密度值； V—样液总体积（ml）； a—测定时样品用量（ml）； W—样重（g）； 五、实验记录与计算： 1、实验记录： 表2 测定对照和样品的OD值 OD值 光照（CK） 正常 盐胁迫 OD1值 0.26 0.084 0.108 OD2值 0.28 0.085 0.106 平均OD值 0.27 0.0845 0.107 2、结果计算： 对照（CK）玉米叶片SOD总活性＝(0.27-0.0845)×5/（0.2×0.5×0.5×0.1）＝1.10U/g 盐胁迫（NaCl）玉米叶片SOD总活性＝(0.297－0.107)×5/（0.297×0.5×0.5×0.1）＝127.95U/g 二、正常条件与盐胁迫下玉米叶片中过氧化物酶活性的测定 一、实验目的：测定正常条件与盐胁迫下玉米叶片过氧化物酶的活性， 并观察其变化趋势。 二、实验原理 在过氧化物酶 (peroxidase) 催化下 ,H2O2 将愈创木酚氧化成茶褐色产物。此产物在 470nm 处有最大光吸收, 故可通过测 470nm 下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。 三、实验材料、仪器与器皿： 1. 实验材料1mol/LNaCl处理24h的三叶一心玉米幼苗未处理的三叶一心玉米幼苗 2. 实验仪器：高速低温台式离心机；分光光度计；试管 3. 实验试剂：0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH6.0 ） 反应液：0.1mol/LPBS 100ml+愈创木酚56μl,混合加热溶解，至室温，然后加30%H2O238μl 四、实验步骤： 1. 酶液的制备：取上个实验中制得的SOD粗提液，用于过氧化物酶活性的测定。 2. 过氧化物酶活性测定： 酶活性测定的反应体系包括： 表3 过氧化物酶活性测定反应体系 反应液(ml)