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实验十二 转氨作用 【实验目的】 1．通过实验掌握水平方向滤纸层析原理和技术 2．了解转氨作用过程。 【实验原理】 转氨基作用是由转氨酶（氨基转移酶）催化的，在这个反应中，α-氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基之间交换，α-氨基酸转变成相应的α-酮酸，α-酮酸变成新的一种α-氨基酸。转氨基作用是一种可逆反应。每个转氨基反应均由专一的转氨酶所催化，在不同的生物有机体中均有转氨酶分布。 本实验是将丙氨酸和α-酮戊二酸与肝匀浆一起水浴反应，肝中的丙氨酸氨基转移酶（ALT，又称谷丙转氨酶GPT）含量丰富，该酶可将丙氨酸的氨基转移给α-酮戊二酸，产生丙酮酸和谷氨酸。利用圆盘纸层析鉴定谷氨酸的存在，并且验证组织中的转氨作用。在肝脏谷丙转氨酶(GPT)催化的转氨基作用，反应方程式如下： 【实验材料】 实验器材 培养皿；表面皿；滤纸；匀浆器；试管；试管架；恒温水浴锅；毛细管；移液管；喷雾器；剪刀；铅笔；格尺。 实验试剂 ⑴ 0.01M pH7.4磷酸缓冲液：0.2MNa2HPO4溶液81ml, 0.2MNaH2P04溶液19ml混匀，蒸馏水稀释20倍。 ⑵ 0.1M丙氨酸溶液：称取丙氨酸0.891克先溶于少量0.01MpH7.4磷酸缓冲液中，以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。 ⑶ 0.01Mａ-酮戊二酸溶液：称取ａ-酮戊二酸1.461克先溶于少量0.01M pH7.4磷酸缓冲液中，用1M Na0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸盐缓冲液加至100ml。 ⑷ 0.1M谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735克先溶于少量0．01M pH7.4磷酸缓冲液中， 以1MNa0H仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。 ⑸ 0.2％茚三酮溶液：称取茚三酮0.2克溶于100ml 95％乙醇中。 (6)层析溶剂：水饱和的苯酚。 【实验操作】 肝匀浆的制备： 取新鲜的猪肝5g,加入20m1预冷0.01M pH7.4磷酸缓冲液，用捣碎机迅速成匀浆(1万转大约30秒)。两人一组进行如下的实验。 转氨反应： 取干燥大试管二支，分别标明测定管与对照管，按下表进行操作： 试剂(ml) 测定管 对照管 肝匀浆 0.5 0.5 放入沸水中煮5分钟， 冷却，摇匀 0.1M 丙氨酸溶液 0.5 0.5 0.01M α-酮戊二酸溶液 0.5 0.5 0.01 M pH7.4 磷酸缓冲液 1.5 1.5 摇匀，放进37℃水浴保温50分钟 沸水浴中煮5分钟，终止反应，取出冷却后摇匀 取出冷却后，分别用滤纸过滤或2000rpm离心3～0.3cm。而且每点一滴，吹干后方可再点第二滴，每个样品可点2～1mm直径)，另取同类滤纸条(0.5×2.5cm)，下一半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，从点样相反的一侧插入小孔。 ⑷ 将层析溶剂(水饱和酚溶液)放入直径为3～～Rf 值。 测定参数 测定样品 谷氨酸 丙氨酸 对照 点样点到斑纹中心距离 (cm) 点样点到溶剂前沿距离 (cm) Rf 值 与已知的标准的氨基酸Rf进行对比，指出条带所对应的氨基酸，并根据结果解释转氨作用。 【注意事项】 1．层析滤纸不可用手触摸，以免有手印。 2．在滤纸上划线时只需用铅笔，不可用其它笔。 3．烘烤时要注意明火。 4．点样时毛细管不能交叉污染。 【思考题】 1．如果对照管在沸水中煮的时间不够充分，会在层析结果中出现什么现象？ 2．氨基酸纸上色谱鉴定法操作的关键是什么？ Experiment 12 Transamination 【Purpose】 1．Master the principles and the basic technological operation of round paper chromatography. 2．Learn the process of transamination. 【Principle】 Transamination reactions are catalyzed by transaminases (aminotransferases). In this process the α-amino group is transferred from an α-amino acid to an α-Keto acid，and the α-amino acid forms an α-Keto acid. In the meantime, the α-Keto acid converts to a new amino acid. Transamination reactions are reversible. Every transamination reaction is cata