实验三十三 木瓜蛋白酶性质测定.doc

实验三十三 木瓜蛋白酶性质测定 一、目的： 1 、学习并掌握木瓜蛋白酶活性的测定基本原理。 ?? 熟练掌握不同的因素如EDTA 、半 胱 氨酸、抑制剂、 pH 等对木瓜蛋白酶活力的影响原理和检测 技术。 ?? 学习和理解酶学动力学曲线的实验设计和实验方法。 二、原理 木瓜蛋白酶（ Papain ）是一种巯基蛋白酶，它分解比胰脏蛋白水解酶更多、更广泛的蛋白底物。它也具有脂酶活力。其分子量约为 23000 左右。在 25 ℃ , pH6.2 时， 1 分钟水解 1 μ mol 分子苯甲酰－ L －精氨酸乙脂的酶量为 1 单位。木瓜蛋白酶是单条肽链，有 211 氨基酸残基折叠成两部分形成裂缝，酶分子只有 1 个巯基，对酶活力是必需的，激活剂有半胱氨酸，硫化物，亚硫酸盐和 EDTA ；抑制剂有巯基试剂，包括重金属和羧基试剂和过氧化氢。 酪蛋白是一种蛋白质，它被木瓜蛋白酶降解生成的酪氨酸在紫外光区 275nm 处有吸收峰， 根据测定 275nm 处的吸收值，可以判定木瓜蛋白酶的酶活力。吸收值的大小与酪氨酸含量的 多少有关，吸收值大说明酪氨酸含量高，也就是说木瓜蛋白酶分 解的酪蛋白多，酶活力高。 三.实验材料 市售木瓜蛋白酶 四.仪器设备 （ 1 ） 磁 力搅拌器（机） （ 2 ） 离心机 4000~1000rpm （冷冻式或非冷冻式） （ 3 ） 752 紫外分光光度计 （ 4 ） 磁力搅拌器 （ 5 ） 水浴箱 （ 6 ）冰箱 五.玻璃器皿（以组为单位） 试管 （ 6 ）， 100 mL 烧杯（ 2 ），吸管（ 1 ）、玻棒（ 1 ），试剂瓶（ 1000 mL 、 500 mL 、 250 mL 等），移液管或移液器 5mL(1) 、 1mL(2) 、 0.5mL （ 1 ），漏斗（ 3 ），滤纸（ 3~6 ）等 六.实验试剂配制及实验步骤 （一）酶活力测定 1 试剂 1 · 3mg/ml 木瓜蛋白酶液（用 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 配制） 2 · 0.1mol/L 的磷酸缓冲液， pH 7.2 3 ·激活剂： 3.1 用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 80mmol/L 半胱氨酸， 3.2 用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制含 8mmol/L EDTA 4 · 1% 酪蛋白溶液：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ pH 7.2 ）配制 5 · 15% 三氯乙酸（ TCA ）溶液 2 方法 管号 0 （对照） 1 （样品） 2( 样品 ) 酶液（ ml ） 0.2 0.2 0.2 激活剂（ ml ） 1.8 1.8 1.8 37 度预热 10 分钟 1% 酪蛋白（ ml ） 0 1.0 1.0 37 度水浴 10 分钟 TCA （ ml ） 2.0 2.0 2.0 1% 酪蛋白（ ml ） 1.0 0 0 摇匀，静置 5 分钟过滤 OD 275nm 0.000 1.001 0.955 ? （二） EDTA 对木瓜蛋白酶活力的影响 1 试剂 激活剂： 1 ·用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ PH 7.2 ）配制含 10mmol/L 半胱氨酸，分别含有 0 ， 0.2,0.4, 0.6,0.8,1,2,4mmol/L EDTA 的 8 种混合液 3 分析 三）半胱氨酸对木瓜蛋白酶活力的影响 1 试剂 激活剂：用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ PH 7.2 ）配制含 1mmol/L EDTA, 分别含有 0 ， 1 ， 5 ， 10 ，20 ， 30 ， 40 ， 50mmol/L 半胱氨酸的 8 种混合液 2 方法 3 分析 （四） 抑制剂对木瓜蛋白酶活力的影响 一、试剂 1 ·配制浓度分别为 0,0.5,1,2,3,4,5mmol/L 的过氧化氢溶液 2 ·用 0.1mol/L 磷酸缓冲液（ PH 7.2 ）配制浓度分别为 0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1% 的 酪蛋白溶液 二、 方法 （ 1 ）不同的抑制剂（过氧化氢）浓度的抑制效果 （ 4 ）不同底物浓度，无抑制剂 （五）不同 PH 值对木瓜蛋白酶活力的影响 1 试剂 1 · PH 5.0 缓冲液 0.1mol/L 乙酸－乙酸钠缓冲液 PH 6.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液 PH 7.0 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液 PH 7.3 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液 PH 7.7 缓冲液 0.1mol/L 磷酸氢二钠－磷酸二氢钠