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山荆子叶总黄酮体外抗氧化活性探究 山荆子（Malus baccata（Linn）Borkh），为蔷薇科（Rosaceae）苹果属多年生木本植物，主要分布于我国东北、华北和西南地区，在蒙古、朝鲜、俄罗斯西伯利亚等地也有分布[1]，吉林省内大部分山区都有分布。随着绿色食品的快速发展，其果实在食品工业中是酿酒和调制纯绿色饮品的原料，多用于加工果脯、蜜饯和清凉饮料等[2]。其叶在我国很多地区可以煮茶用来减肥[3]。目前，国内针对山荆子果实和叶的化学成分及药理作用研究还鲜有报道，其果实中的主要化学成分包括萜类、酯类、烯烃类、多酚类以及黄酮类化合物，同时还含有锰、硒和锌等微量元素[4, 5]。而叶中的主要成分为多酚类和黄酮类化合物[6]。与此同时，现代药理作用研究表明，山荆子果实中的多酚类成分具有对辐射诱导的机体氧化损伤的保护作用[7]，山荆子不同溶剂提取物具有明显的抗氧化活性，且其中乙酸乙酯提取物和丙酮提取物分别对人类子宫癌HeLa 细胞和肝癌HepG2 细胞增殖具有抑制作用[8]。另外，山荆子叶提取物对脂肪酸合酶具有抑制作用，显示其可能应用于减肥[3]。叶提取物还能够明显的改善糖尿病小鼠血糖和血脂的紊乱[6]，并对CCl4 诱导的小鼠肝损伤具有较好的保护作用[9]。本研究对山荆子叶不同溶剂萃取物的总黄酮含量进行测定，对提取物的体外抗氧化活性进行比较，并初步探讨其黄酮含量与体外抗氧化活性的关系，为开发和利用山荆子资源提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 山荆子叶于2015 年10 月采于长春市郊，经长春中医药大学药学院教授李勇鉴定为蔷薇科（Rosaceae）苹果属（Malus）植物山荆子的干燥叶。芦丁标准品：中国药品生物制品鉴定所；1,1- 二苯基-2- 苦肼基自由基（DPPH），ABTS 购自美国sigma 公司；Vitamin C 中国医药集团上海化学试剂公司；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、焦性没食子酸、过硫酸钾、硫酸亚铁等药品均为分析纯试剂购自国药集团化学试剂公司。 1.2 仪器与设备 TU-1810 型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SpectraMax Plus384 型酶标仪。美国MolecularDevices 公司；RE-3000 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；KQ-118 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；SHB- ⅢA 型循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；FA2004N 型分析天平， 上海精密科学股份有限公司；HH-S 型恒温水浴锅，江苏省金坛市正基仪器有限公司。 1.3 实验方法 1.3.1 提取阶段精确称取50 克干燥后山荆子阴干叶，剪碎，置于1000 毫升圆底烧瓶中，加入500 毫升蒸馏水，浸泡过夜，加热回流2 次，每次2 小时。提取液减压浓缩至400 毫升。加入95%乙醇至醇浓度为80%，静置过夜，抽滤，上清液减压浓缩至体积为400 毫升，然后依次将提取液分次用等体积的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取各萃取2 次，不同溶剂萃取液减压浓缩，干燥后得浸膏，浸膏质量分别为：氯仿部分376.24 毫克，乙酸乙酯部分34.31 毫克，正丁醇437.79 毫克，水提液1232.37 毫克。 1.3.2 总黄酮含量测定总黄酮含量测定方法参照胡卫成等的方法制作芦丁标准曲线。精密配制0.2 毫克/ 毫升对照品芦丁的标准液，精密吸取芦丁对照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0 毫升分别置于10 毫升容量瓶中，然后加入5% NaNO2 溶液0.3 毫升，摇匀，放置6 分钟，加入10 %Al（NO3）3 溶液0.3毫升，摇匀，放置6 分钟，加入4 % NaOH 溶液4.0 毫升，最后加入80 %乙醇溶液定容至刻度，摇匀，放置15 分钟。以80%乙醇溶液为空白对照，用紫外分光光度法于515 纳米波长处测定上述标准溶液吸光度，制作标准曲线。计算总黄酮含量。山荆子叶提取液和不同溶剂萃取物按上述方法进行实验，与515 纳米波长处测定吸光度，计算总黄酮含量。 1.3.3 抗氧化活性的测定 1.3.3.1 清除DPPH 自由基活性实验DPPH 用甲醇溶解配制成0.16 毫摩尔/ 升DPPH 甲醇溶液。取不同浓度的样品甲醇溶液和Vc 甲醇溶液100 微升分别加入96 孔板并加入100 微升的DPPH 溶液，空白用甲醇代替样品溶液。于波长517 纳米下测定其吸光度。每份样品平行操作3 次。 清除率（%）=[A 空白-A 样品]/A 空白times;100 提取物的半数抑制率用IC50 值表示 1.3.3.2 清除ABTS 自由基活性的测定ABTS 阳离子自由基的产生是通过ABTS 原液与过硫酸钾在室温黑暗中反应12~16小时完成，在供氢抗氧化剂存在的情况下，ABTS+ 自由基