夏常艳－genomicsequencingofsingle-生物化学与分子生物学.pptVIP

第二组成员：夏常艳 学号4/22/2009 20世纪人类对微生物的利用 目前一般将微生物分为真菌、放线菌、细菌、螺旋体、立克次体、衣原体、支原体和病毒。 自从19世纪后期巴斯德在酿酒、蚕病及狂犬病疫苗方面发展了微生物生理学及其应用以来，由病原微生物改造制成的预防疾病的疫苗是微生物对人类最突出的贡献。 1929年弗莱明在进行细菌培养时，偶尔观察到青霉菌周围有明显的抑制金黄色葡萄球菌生长的“抑菌圈”，从而发现了青霉素，开创了抗生素研究的时代。 应用微生物产物作为畜用添加剂，研究固氮菌及其质粒以促进农业生产，利用微生物处理垃圾及污水，用微生物处理废弃的化学武器等均是微生物在各个领域的贡献所在。 微生物基因组研究 20世纪90年代后期开始了微生物基因组的研究。这项研究是从对微生物完整的全基因核苷酸测序入手，在分析基因结构的基础上，认识微生物的完整生物学功能。微生物基因组计划（Microbial Genome Program）被认为是生命科学领域的一项大工程。 到1999年2月，已完成了对15种细菌基因组的测序，其中包括幽门螺杆菌、结核杆菌、梅毒螺旋体、酿酒酵母菌、肺炎支原体等 。微生物基因组研究成果转入开发应用周期短，具有更高的经济价值。 微生物基因组研究具有目标明确、相对投入少、收效快、成果易于转化为产品等许多优点。 微生物基因组及其功能的研究将导致一场影响深远的生命科学的革命。  基因测序技术 目前应用的快速序列测定技术可以总的概括为两种：合成法和降解法。基于Sanger等（1977）提出的酶法及Maxam和Gilbert(1977)提出的化学降解法这两种基本思想。 传统用于DNA测序的方法有毛细管微阵列电泳测序和焦磷酸测序等，这些方法往往技术要求高、成本贵，而且容易出错。 截至2007年，第二代基因测序方法已经普遍推广应用，极大地降低了测序的成本和时间，实现了高通量测序。 2008年又提出了更快更好的第三代测序方法---单分子测序（SMS） sequencing of single microbial cells 基因测序需要一定量的DNA模板，所以测序前需对微生物进行分离和培养，但是环境中大多数的微生物是不可培养或对培养条件要求很高的，这无疑给测序增添了难度。 通过一种叫做多重置换扩增（multiple displacement amplification，MDA）的技术，不需要进行微生物培养，可以直接扩增放大单个细菌中的DNA获得作为模板所需的微克DNA 。 整个实验包括环境样品的准备、单细胞分离、MDA扩增DNA和DNA测序等。 环境样品的处理 富集环境样品中的微生物片段以利于分离单个细胞。分离单细胞前土壤先经过密度梯度离心预处理。如果是水样本，假如对生物体浓度有要求则要考虑附带过滤。 离心、液体加压冲击法、过滤和静电沉积法 。 液压冲击型空气收集器可使细胞悬浮在用于分离单细胞的溶液中，可高效地捕获液体基质中1-10μm的微粒。 分离单细胞 根据所需要的生产量、环境以及靶生物体等情况，可以通过采用稀释法、荧光活性细胞筛选（FACS）、显微操作和微流体分离到单个细胞用于MDA，采用FACS可以在一分钟内分离到上千个细胞。 单细胞分离结合荧光原位杂交（FISH）可以富集特异的菌属，机械的显微操作（基于体外受精的装备）结合现代研究显微镜方法可以高效地分离到单细胞，如跟FISH结合从环境样本中筛选出特异的种类用于MDA扩增单细胞DNA实验。 大小 悬浮在溶液中的相互离散颗粒。 大小范围：0.2uM-300uM。 对象类型 细胞类型： （1） 高等真核细胞； （2）酵母； （3）细菌； （4）多细胞的聚集体，如胰岛等。 非生命颗粒： 细胞核、染色体、和其它细胞器以及乳化微球等。 通过MDA扩增DNA 多重置换扩增(Multiple dilacementamplification，MDA)是1998年由耶鲁大学Lizardi博士首次提出。这种恒温扩增的方法依赖于链置换扩增原理，利用噬菌体Φ29DNA聚合酶，高度扩增DNA。该酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100Kb?的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’?-5’外切酶活性，错误率仅为5 x 10-6，大约比Taq DNA聚合酶低100倍，因此可以保证扩增的高保真性。 Φ29DNA聚合酶强大的向前延伸活性和高保真度，使得通过MDA可从极少量的DNA样本获取大量高质量的DNA，是到目前为止对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏