HCV复制子用于抗丙肝中药的筛选和组方.pdf

中文摘要 HCV复制子用于抗丙肝中药的筛选及组方 摘 要 Health 丙型肝炎是全世界流行的传染病。据世界卫生组织(World 者约为4000万。丙型肝炎易于慢性化，病情隐匿性进展，至出现临床症 状时，常已出现了肝纤维化、肝硬化甚至肝癌。丙型肝炎的治疗目的是清 C 除病毒，目前干扰素联合利巴韦林是抗丙型肝炎病毒(hepatitis 约50．60％的丙型肝炎患者无法从中获益。新近上市和目前正在研究的多 种蛋白酶抑制剂均需与干扰素联用，单独应用短期内即出现耐药，因而临 床迫切需要探索新的治疗手段。现代医学发现一些中药具有抗病毒作用， 但针对抗HCV中药筛选的报道极少，且前期研究多采用裸鼠接种实验， 成本高，工作强度大，难以做到高通量筛选。本研究采用同时表达新霉素 验系统，利用血浆药理学的实验方法，筛选抗HCV中药。由于动物血浆 超过一定浓度会对细胞产生毒性作用，所以我们在第一部分首先探讨了在 细胞培养条件下动物血浆对细胞的影响，确定了最适血浆来源动物种属及 血浆的最佳作用时间和添加浓度；在此基础上，第二部分对16种可能有 较高抗HCV作用的中药进行筛选，组方并验证。 第一部分细胞培养条件下动物血浆对细胞的影响 目的：将H7．HCV-L7细胞接种于裸鼠皮下，制备裸鼠体内适应性细 血浆，确定血浆的最佳作用时间和添加浓度。 方法： 中文摘要 mH7-HCV-L7细胞24h、48h、72h的细胞毒性进行比较； 应用CCK．8法对其细胞毒性进行分析，确定最适血浆来源动物种属及血 浆的最佳作用时间和添加浓度。 。 结果： mH7．HCV-L7细胞组的光密度(Optical 性均增加； 1．2 于相应的作用于H7．HCV-L7细胞，其他浓度及时间点则无明显统计学差 异； ． 1．3 细胞存活率分别为75．30％、57．29％、21．12％、) 2小鼠、大鼠、兔血浆作用于H7．HCV-L7细胞的细胞毒性比较： 2．1相应时间点相同浓度的动物血浆比较，均以小鼠血浆的OD值最低， 兔血浆的最高，大鼠血浆的居中； 照组，P0．05，差异有显著性； 2．3 O．05，统计学无明显差异，既有血浆本身对细胞的毒性作用，又有其作为 营养物质对细胞生长的促进作用；40％兔血浆组与DMEM对照组48h的 结论： 浆； 中药物成分本身可能对细胞生长产生促进或抑制作用，故为留有余地，确 中文摘要 定后续筛选抗HCV中药时兔血浆的添加浓度为20％。 第二部分应用血浆药理学方法及HCV复制子筛选抗丙肝中药及组方 目的：筛选出对HCV抑制率较高的中药，组方并验证。 方法： 法，对16种可能有较高抗HCV作用的中药(黑蕊虎耳草、大血藤、五爪金 龙、白雪花、云南美登木、栀子、滇丹参、苦参、鸡爪大黄、山豆根、苦 味叶下珠、红腺忍冬、龙胆草、黄芩、肉桂、女贞子)进行筛选： 1．1制备含药兔血浆及空白兔血浆； 1．2应用CCK-8法及48孑L,板做H7．HCV-L7的标准曲线； 空白兔血浆，持续作用48dx时； 1．4应用CCK-8法测定各孔光密度(Optical 活率及各孔细胞数； 光值，计算各孔单个细胞荧光值； 1．6计算各中药抗HCV抑制率，从高到低进行排名比较 2选取抑制率较高的中药组方并验证 2．1根据细胞毒性、抑制率排名、各中药性味功效及临床常用治疗肝病中 药方剂，选取中药组方如下： 方一：大血藤129、五爪金龙89、云南美登木459、黄芩69 方--．女贞子109、五味子59、黄芪209、党参109 方三：大血藤129、五爪金龙89、云南美登木459、黄芩69、 女贞子109、五味子59、黄芪209、党参109 2．2测定各中药组方抗HCV抑制率并进行排名比较：同方法1。 3进一步验证