IGF-1基因转染的神经干细胞移植治疗HIBD新生大鼠的探究.pdf

摘要 I GF-1基因转染的神经干细胞移植治疗 …BD新生大鼠的研究 硕士研究生： 吴值荣 导 师： 王军教授 专 业： 儿科学 郑州大学第三临床学院 河南 郑州450052 摘要 brain damage，HIBD)是新生 新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic．ischemic 儿期常见的疾病，是指由各种原因，主要指围生期窒息，引起的脑组织部分或 完全缺氧、脑血流减少或暂停而造成的神经细胞的大量凋亡、坏死，脑水肿， 脑室周围白质囊泡化，继发脑组织重建，导致大脑结构及功能受损，造成相应 的神经功能障碍，并且出现严重的后遗症，是引起新生儿急性死亡和慢性神经 系统损伤，新生儿后期神经系统伤残(智力低下、癫痫、脑瘫)的主要原因之 一。近年来，随着新生儿抢救技术的日益提高，脑损伤的发病率不但未降，反 而有升高趋势。目前的治疗方法旨在缓解症状和控制更进一步的脑损伤，疗效 stemcells，NSCs)以其自我更新、持续分裂增殖能 欠佳。神经干细胞(neural 力及多潜能分化的特点，替代受损的神经细胞，整合入宿主组织的神经环路， 抑制神经细胞的凋亡，促进神经功能的修复，成为治疗神经系统疾病的理想种 子细胞。 在神经干细胞来源方面，与神经系统细胞移植治疗中其它细胞来源相比， 脐血干细胞以其来源丰富，抗原性弱，移植物抗宿主病发生率低、反应轻，不 涉及社会伦理道德及法律等优势成为神经干细胞的新来源。因此使用脐血干细 胞定向诱导分化为NSCs用于临床研究有广阔的应用前景；同时神经干细胞是基 因转染的良好载体，利用基因转染技术，将目的基因通过载体(如脂质体、病 毒、多种阳离子物质及磷酸钙等)转染入神经干细胞，待检测出其稳定表达后， 摘要 再将含有目的基因的神经干细胞进行移植。基因修饰的神经干细胞不但可以起 到细胞替代的作用，而且目的基因分泌的营养因子可以改善脑损伤局部的内环 境促进轴索的再生。 likeGrowth 胰岛素样生长因子l(Insulin Factor-1，IGF．1)在中枢神经系统发 育和成熟的全过程中发挥着重要作用，是促进大脑发育所必需的神经营养和神 经保护因子。最近的研究发现，IGF．1对一些中枢神经系统损伤性、退行性及神 经毒性等疾病具有明显的治疗作用，可以保护神经细胞，抑制神经细胞的调亡， 减轻伤后功能丧失，促进伤后功能重建。 既往的研究显示单用IGF．1因子或单独移植NSCs均能对动物HIBD模型发 挥重要的治疗作用，本课题采用NSCs移植和IGF．1联合，即将IGF．1基因转染 作用。 目的 (1)本实验研究脐血源性NSCs体外分离、培养及诱导分化的方法，观察 细胞增殖分化情况。 NSCs内，构建基因工程化的神经干细胞(NSCs．IGF．1)。 脑内的存活及迁移分布情况，并对脑损伤大鼠神经功能恢复的情况进行研究， 为临床上应用基因转染NSCs移植治疗HIBD提供实验依据及理论基础。 方法 (1)采用密度梯度离心法从人脐血中分离出单个核细胞，用hEGF、bFGF 和B27因子定向诱导其向神经干细胞方向分化，观察培养过程中脐血单个核细 胞增殖分化的特点，免疫细胞化学法检测神经细胞特异性标志物Nestin、NSE、 GFAP的表达情况；BrdU试剂标记培养细胞，并测定BrdU阳性细胞表达率。 DNA 分别由DNA限制性内切酶BamHI与Hi