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TUNEL方法检测凋亡的讨论 TUNEL方法检测凋亡的原理 ljksbs ：细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用. TUNEL细胞凋亡详细流程 youngtiger： TUNEL法原位标记凋亡检测试剂盒 细胞发生凋亡以后，出现多个生物学改变特征，如：细胞膜、染色质凝集、核DNA断裂等等。目前DNA断裂检测是一种广为认可的检测凋亡的方法，这种检测可以通过提取细胞DNA进行凝胶电泳来完成，也可以进行原位检测，即常说的TUNEL（TdT介导的dUTP缺口末端标记技术）方法。 TUNEL方法的基本原理如下：在TdT酶的作用下，将生物素或者溴标记的核苷酸连接到细胞内断裂DNA游离的3OH上，然后加入酶标的链霉亲和素或者抗标记核苷酸的抗体，达到原位检测目的。 试剂盒简单操作步骤：* 细胞或组织片固定（中性固定液，如3.7％甲醛）* 水化（样本依次在100%、95%、70%的乙醇处理）* PBS浸泡* 蛋白酶K处理标本（蛋白酶K主要应用于组织样本和对照片，Cytonin用于新鲜准备的细胞样本）* 双蒸水（dH2O）洗涤* 3%H2O2甲醇溶液（Quenching solution）消除内源性HRP* PBS中洗涤* 1XTdT标记缓冲液孵育* TdT标记Biotin-dNTP（TdT标记反应混合物）* 终止标记反应（1XTdT Stop Buffer）* PBS洗涤* Streptavidin-HRP孵育（若使用荧光标记的Streptavidin，则无需进行以下步骤，直接在荧光显微镜下观察）* PBS洗涤* DAB溶液显色* 去离子水中洗涤* 甲基绿溶液复染 使用TUNEL试剂盒基本注意事项：* 避免将试剂盒保存于无霜冰箱中* 使用PH中性的固定液固定组织或者细胞，避免使用酸性或者碱性固定液，以免出现认为DNA损伤；推荐使用 3.7％甲醛溶液）* 在操作过程中避免出现干片现象* 根据标本类型决定孵育时间（蛋白酶K、TdT等），保证最佳效果* 使用过程避免将TdT酶置于冰上；避免反复冻溶。* 使用试剂盒提供的二价阳离子优化标记反应（Mg2+可降低背景，Mn2+可增强染色；建议使用Co2+开始反应）* 按照正确的顺序准备标记混合物；最后一步加入标记缓冲液* 使用新鲜的H2O2溶液，孵育后立即将标本放入PBS清洗（H2O2可导致DNA损伤） liufaquan：应用原位DNA末端转移酶法（TUNEL）观察细胞凋亡（1）细胞生长片原位，2%为多聚甲醛固定15min，PBS 漂洗5min×3（2）甲醛、过氧化氢（0.03%）15min，消除内源性过氧化物酶的活性（3）PBS漂洗5min×3，0.1%TrionX-100 4℃条件下孵育2分钟（4）滴加DNA末端转移酶及FITC标记dUTP反应混合液50μl，37℃ 湿盒内孵育1h(1号+2号)（5）PBS漂洗5min×3，滴加HRP（辣根过氧化物酶）标记的抗FITC抗体(3号)，37℃湿盒内保温1h.（6）DAB暗处显色5min，终止显色。镜下观察、摄影。阳性细胞为胞核呈棕黄色，不着色为阴性。同时用PBS代替DNA末端转移酶，作为阴性对照。 nixiao：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca 2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行