如上次试验提取的puc19质粒.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【思考题】 1.影响PCR扩增的因素有那些？ 2.分析电泳后DNA带拖尾的原因。 3.分析电泳后无带的原因。 【实验安排】 下午PCR扩增，晚上电泳检测 * 三峡大学李晓玲编写与制作 * Thanks for your cooperation and understand * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 质粒 pUC19示意简图 * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 多克隆位点 启动子 裂开的N端 裂开的N端 外源DNA ? ? 半乳糖苷酶N端编码序列 pUC19 2686bp pUC19 2686bp 染色体 重组体pUC19 细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂IPTG的琼脂上培养 细菌在含X-gal和乳糖操纵子诱导剂的琼脂上培养 pUC19 含重组体pUC19的白色菌落 蓝色菌落 含载体pUC19的蓝色菌落 ? 半乳糖苷酶 C端编码序列 转化 转化 利用 ? 互补原理筛选重组子pUC19 amp r amp r * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【仪器、材料和试剂】 （一）仪器 1.台式离心机 2.电热恒温水浴锅 3.恒温摇床 4.恒温培养箱 5.超低温冰箱 （二）材料和试剂 1.菌株： E.coli DH5α 2.质粒：PUC19质粒 3.LB培养基 4.含抗菌素的LB平板培养基（氨苄青霉素，浓度 50-100μg／ml） 5.培养皿、接种针、玻璃涂棒、试管、酒精灯、镊子、牙签等 6.预冷CaCl2溶液（0.1mol／L） * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【仪器、材料和试剂】 7.二甲基甲酰胺 8.T4DNA连接酶 9.λDNA 10.EcoRⅠ酶 11. 3mol/L KAc (pH5.2) 12.Xgal:将Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/ml，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于－20℃。 13.IPTG:取2g IPTG溶于8ml双蒸水中，再用双蒸水补至10ml,用0.22μm虑膜过滤除菌，每份1ml,贮存于－20℃。 14.TE缓冲液 10 mmol/L Tris.HCl(Ph8.0) 1mmol/L EDTA * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【实验步骤】 （一）质粒DNA的提取 按实验一的方法提取质粒 （二）制备重组DNA 1、在灭菌的Eppendorf管中，加入pUC19质粒1μl（2ug/ul），2μl酶切缓冲液，1μlEcoRI酶，无菌双蒸水15μl，至反应混合物总体积为20μl，离心均匀，37℃反应3h(酶及缓冲液应放在冰上）。 * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 2、在另一无菌Eppendorf管中，加入λDNA 1.5ug,加入1μl酶切反应液， 1μl（2U）EcoRI酶，无菌双蒸水补到10μl，37℃反应3h。 3、反应完毕后各取2μl酶解液做电泳分析。 4、分别将余下的酶解液加入1/10体积的3mol/L KAc（pH5.2)溶液，再加入2倍体积的无水乙醇，－20℃冰箱，2h（沉淀DNA）。12000r/min 4 ℃离心15min，弃上清，加70％乙醇洗涤沉淀物，再离心，去上清，真空干燥后，加5μlTE溶液。 5、将酶切后的2个DNA片断混合于一管中，加T4DNA连接酶缓冲液2.5μl， T4DNA连接酶1μl ,加16.5μl无菌双蒸水,14 ℃保温14h ，并做转化实验。 【实验步骤】 * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【实验步骤】 （三）制备涂菌的琼脂板 LB培养基含10μg/ml氨苄青霉素，琼脂15g/l倒入培养皿，凝固4℃保存。 （四）制备感受态细胞 1、按实验3的方法制备感受态细胞。 2、在200μl新制备的感受态细胞中，记入5μl连接产物，混匀，冰上放置30min，同时做两个对照管。 受体菌对照：200μl感受态细胞＋2μl无菌水 质粒对照： 200μl0.1mo1／L CaCl2溶液＋2μl质粒DNA溶液 3、将管放到 42℃水浴中保温1－2min， 4、冰上冷却1－2min。 5、每管中加入0.8ml LB液体培养基，（轻轻混匀）。37℃温浴45min，慢摇 ， * * 三峡大学李晓玲编写与制作 * 【实验步骤】 6、在预制的LB琼脂板上，加40μl20mg/ml Xgal 和4μl 200mg/m l IPTG溶液，并用灭菌玻璃推子（酒精灯上烧后冷却），均匀涂布于琼脂凝胶表面。 7、将