表达β淀粉样蛋白3-10和白细胞介素4融合蛋白的DNA疫苗的构建和免疫效果研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 表达P淀粉样蛋白3．10及自细胞介素4融合蛋白的 DNA疫苗的构建及免疫效果研究 莉 昌 阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)是一种慢性的神经系统变性病，是 老年人进行性记忆障碍和认知功能障碍的最常见的原因。目前，AD的原因不清楚， 也没有满意的治疗方法。AD的神经病理表现在大体病理呈弥漫性脑萎缩，镜下病 理包括老年斑(SP)、神经元纤维缠结(NFT)和脑内的神经元缺失。老年斑的主 酶酶解产生。AD病因学的著名假说是淀粉样蛋白瀑布假说，该学说认为Ap的异 常聚集在AD的起病及进展中起到核心作用。清除聚集的Ap和／或阻止Ap的形成 和聚集可能成为有效的抗AD的治疗策略。 免疫治疗可能是最有希望阻止和清除Ap聚集的方法之一。研究表明，用A1，42 肽免疫AD模型鼠时能够产生高滴度的抗Ap抗体，减少鼠脑内Ap的沉积，并能 使鼠的学习和记忆功能得到改善。Ap疫苗(ANl792)在1I期临床试验时，因为 6％的病人出现了无菌性脑膜脑炎而被迫停止。随后的研究认为无菌性脑膜脑炎由 T细胞介导的自身免疫反应(1111型免疫反应)引起，与抗体无关。而且111l型 免疫佐剂组合的选择，包括皂角素(QS．21)和聚山梨醇酯80，加剧了nll型免 疫反应。尽管这些病人没有接受全程的主动免疫，仍然有60％病人产生抗Ap抗 体，产生高滴度(20％)抗体的病人的认知功能减退的速度明显下降。对免疫病 人的随访研究发现Ap42免疫能清除病人脑内的Ap沉积。 被动免疫研究用抗Ap抗体免疫APP转基因鼠能减少鼠的老年斑沉积并改善 行为学。目前正在进行着多个人源性单克隆抗Ap抗体的临床试验。但是被动免 疫也有其缺陷，如需反复注射，成本昂贵，需要足够的血脑屏障渗透能力及出血 的危险等。所以仍然需要寻找安全有效的AD免疫治疗策略。研究认为主要诱导 Th2型免疫反应的免疫方式对于AD的预防和治疗是安全的。为了建立一种能产 生Th2型免疫反应的安全AD免疫，研究者进行了一些实验性免疫策略的探索， 包括选择Ap的B细胞表位比如ADl-15，免疫佐剂修饰，改变免疫途径及疫苗运送 机制等。同时一些研究表明编码AD的DNA疫苗免疫小鼠可以产生特异性的抗AD 抗体，产生B细胞免疫反应，却不发生有害的T细胞介导的免疫反应。 已经被确认是B细胞表位。为了克服Ap3．10肽段小免疫原性弱，我们编码了重复 10次的AD3．10片段作为目的基因。而且选择Th2型细胞因子IL．4作为佐剂加到 P(Afl3q0)lo．raiL-4，并进一步探讨其作为AD疫苗的安全性及免疫效果。 实验方法 kozak sequence—(AB弘lo)lo一-(．舢S 杆菌DH5a扩增并大量提取。重组质粒经琼脂糖凝胶电泳及测序鉴定。脂质体方 法将质粒转染HEK293细胞。用Western blotting方法检测表达产物。将重组质粒 体外脾细胞培养上清中的细胞因子。免疫组化的方法检测抗血清对APP／PSl转基 法测定免疫后血清中的抗体滴度、抗体分型、体外脾细胞培养上清中的细胞因子 及鼠血清和脑组织中的AB含量。水迷宫的方法检测转基因鼠的学习记忆能力。 免疫组化的方法检测鼠脑内的老年斑、星形胶质细胞、小胶质细胞及鼠脑内的炎 症反应。 实验结果 一、质粒成功构建并转染HEl(293细胞 2 重组质粒成功构建，经酶切及测序鉴定序列正确。成功转染HEK293细胞， 表达融合蛋白。 二、重组质粒免疫BALB／c小鼠的免疫效果 1、血清抗体及分型测定 主，p(Ap3-10)lo-mIL-4组IgGl／IgG2a比值约是Ap42组的8倍。 2、重组质粒免疫后BALB／e小鼠脾细胞培养上清的细胞因子检测 P(A153-10)lo-raiL-4组及pcDNA3．1(+)组。 3、抗血清与AP阶Sl转基因鼠脑内的老年斑相结合 dx鼠后产生 经免疫组织化学染色证实重组质粒p(AB3-loho-mIL-4免疫BALB／c 的抗血清能与10月龄的APP／PSI转基因鼠脑内的