红曲霉固态发酵生产洛伐他汀工艺条件探析.docVIP

红曲霉固态发酵生产洛伐他汀工艺条件探析 　　洛伐他汀是红曲霉培养物中具有生理活性功能的产物之一，由于其是胆固醇合成限制酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂，可以抑制生物体内胆固醇的合成[1-2]，所以近年来洛伐他汀类药物的开发一直是人们研究功能性红曲的热点。红曲霉生产红曲一般采用固态发酵技术，该方法具有投资少、产量大、生产技术成熟等优点，国内对红曲霉固态发酵生产洛伐他汀的研究多有报道[3-6]。本实验采用传统的红曲生产方法，利用地域原料优质资源进行红曲霉固态发酵，对其产洛伐他汀的发酵工艺条件进行了研究和探索。 　1 材料和方法 　1.1 供试材料 　1.1.1 试验菌种 洛伐他汀生产菌红曲霉M7（由天津科技大学食品生物技术研究室提供）。 　1.1.2 培养基 （1）斜面培养基：麦芽汁培养基，121℃灭菌20min。（2）种子液培养基（g/L）：葡萄糖50g，蛋白胨20g，NaNO3 10g，MgSO4·7H2O 5g，KH2PO4 10g，自来水1 000mL，121℃灭菌20min。（3）发酵培养基：将大米与蒸馏水以 　1（g）∶1（mL）的比例浸泡过夜，沥干水分，分装入250mL三角瓶中，每瓶20g原料，20mL蒸馏水，121℃灭菌20min。 　1.2 培养条件及方法 （1）斜面培养：挑取一环菌种接种于斜面培养基中，在32℃培养箱中培养6～8d，至菌丝长满斜面。（2）种子液培养：取5mL无菌水加入到新鲜的斜面菌种中，将斜面上的孢子充分刮下，制成菌悬液，接种到装有50mL种子培养基的三角瓶中，30℃ 180r/min培养36h，得到红曲霉的种子液。（3）发酵培养：向发酵培养基中加入已调好浓度的种子菌悬液5mL，淋匀，置于28℃恒温培养箱中培养。18～20d后取出烘干至恒重、粉碎，检测洛伐他汀含量。 　1.3 样品处理 发酵样品于40℃烘干至恒重，粉碎，过100目筛。准确称取0.500 0g红曲样品，加入8mL75%乙醇，超声30min，3 500r/min离心10min。用75%乙醇定容至25mL，经0.45mu;m滤膜过滤后检测。 　1.4 色谱条件 （1）洛伐他汀标样：酸型和内酯型分别制备。（2）色谱柱：Agilent TC-C18（5mu;m，4.6mmtimes;250mm）；流动相：乙腈∶水=7∶3；（3）检测器：紫外检测器，检测波长为lambda;=237nm；（4）柱温：25℃；流速：1mL/min；进样量：20mu;L。 　2 结果与分析 　2.1 不同发酵温度对洛伐他汀产量的影响 在实验中设计了5个发酵温度，分别为24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，在不同温度的培养箱中发酵培养18d，检测洛伐他汀含量，实验结果如图1所示。由图1可以看出，培养温度对M7产洛伐他汀十分敏感，在26～28℃时最为合适，因此确定最佳发酵温度为26～28℃。 　2.2 不同发酵培养时间对洛伐他汀产量的影响 由图2可以看出，洛伐他汀从第二天开始合成，随着培养时间增加，产量逐渐增多，直到第18d达到最大值，随后产量略有减少，所以确定最佳的发酵培养时间为18～20d。 　2.3 不同发酵基质初始含水量对洛伐他汀产量的影响 水分是保证微生物生长繁殖的重要因素。实验中对发酵基质初始含水量进行了设计研究，选取发酵基质初始含水量分别为30%、40%、50%、60%、70%，考察其对洛伐他汀产量的影响，结果见图3。由图3可以看出，当基质含水量达到50%时，洛伐他汀的产量达到最大值；当基质含水量低于50%时，物料干硬，菌体生长缓慢；当含水量超过50%时，洛伐他汀产量下降，过多的水分会导致基质物料黏结成团，容易感染杂菌，发酵进行困难，影响菌体的生长。 　2.4 发酵基质初始pH值对洛伐他汀产量的影响 实验中设计了5个发酵起始pH值，分别为4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，在26℃培养箱中进行发酵培养，测定洛伐他汀产量，结果见表1。从表1可知，起始pH值在4.0～6.0时，洛伐他汀的产量较高，这一pH范围也是红曲发酵的自然pH，所以试验中对发酵基质的初始pH值没有作特殊要求，选择自然pH值。 　3 结论 　利用红曲霉固态发酵生产洛伐他汀，在发酵过程中温度、培养时间、基质初始含水量和基质初始pH的变化对洛伐他汀的产量有较大的影响。本试验根据以上因素优化了红曲霉固态发酵生产洛伐他汀的最佳工艺条件为：发酵温度26～28℃，发酵时间18～20d，发酵基质初始含水量50%，发酵基质初始pH值自然。 　参考文献 　[1]Seraman S，Rajendran A，Thangavelu V.Statistical optimization of anticholesterolemic drug lovastati