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脂肪酸标志法探究池塘悬浮颗粒物及附着基生物组成季节性变化对
脂肪酸标志法探究池塘悬浮颗粒物及附着基生物组成季节性变化对
脂肪酸是所有生物体的重要组分,是迄今所知的细菌体、微藻类、陆地高等植物、海洋动物区系中含量最高的脂类物质,主要以三羧酸甘油脂和磷脂的形式存在[1]。作为生物标志物,脂肪酸有几大优越性:第一,生物体脂肪酸的组成和累积是长期摄食活动的结果,因而以脂肪酸为示踪判断生物食性可以有效降低因生物的偶食性引起的偏差;第二,脂肪酸在生物体新陈代谢过程中比较稳定,经生物消化吸收后结构基本保持不变;第三,动物自身无法合成必需脂肪酸,其体组织内的必需脂肪酸只能依赖于其所摄入的食物,从而提高了以必需脂肪酸作为营养标志物进行食性溯源的可信度[2-5]。
目前,脂肪酸标志法已广泛应用于海洋生物食物关系的相关研究中[6-11],高菲等[12]通过分析刺参体组织脂肪酸的变化,运用脂肪酸标志法推断刺参食物来源的季节性变化,没有分析食物环境中脂肪酸组成的变化。本研究同时分析了刺参养殖池塘悬浮颗粒物、附着基附着物和刺参体组织脂肪酸组成的季节性变化及二者之间的相关性,以阐明食物环境的变化对刺参食物来源的影响,揭示池塘养殖刺参食性的季节性变化。
1材料和方法
1.1样品采集
实验于2012年5-12月在山东好当家海洋发展股份有限公司靖海湾刺参养殖基地(37deg;17prime;N,122deg;42prime;E)进行。实验期间采集刺参、悬浮颗粒物及附着基样品四次,采样时间为2012年5月20日、8月10日、10月12日和12月23日,分别代表春季、夏季、秋季和冬季样品,每次采样均设四个相同站点。样品采集时,从每个站点随机选取刺参12~16头,用无菌纱布擦干并去除石灰环后,剪取体壁组织。每2~3头刺参的体壁组织合并作为一个样本置于-80 ℃冷冻保存,每个站点刺参样品设置5个重复;使用药勺轻轻刮取附着基(附着基由6个直径 15 cm、长40 cm的聚氯乙烯带孔空管捆绑组成)表面的附着物,每个站点附着基样品设置4个重复;用采水器于每个站点15 m水深处采集2 L水样,采集到的水样立即用在马弗炉中 450 ℃ 下灼烧4~5 h左右的玻璃纤维膜(GF/F,孔径0.7 mu;m,直径45 mm)真空过滤,收集水体中的悬浮颗粒物;每个站点的悬浮颗粒物样品设置4个重复;刺参、附着基及悬浮颗粒物样品冷冻干燥至恒重,用组织粉碎机粉碎后,于-80 ℃ 密封保存备用。实验器具均用10%盐酸浸泡,并用二次蒸馏去离子水冲洗。
1.2样品处理
(1)称取80 mg冷冻干燥后的刺参样品或300 mg冷冻干燥后的附着基或合并的同一围隔的2张GF/F膜样,置于10 mL试管中。加入1N KOH-甲醇溶液3 mL(附着基附着物和悬浮颗粒物样品另加1 mL氯仿)后,超声波处理30 min以破碎细胞壁。处理后的溶液于75~80 ℃水浴中加热15~20 min,然后放置冷却至室温。
(2)加2N HCl-甲醇溶液3 mL,于75~80 ℃水浴中加热20 min,冷却至室温。
(3)加正己烷1 mL,振荡萃取,静止分层(需要时稍加水有助分层)。
(4)将上清液转移到1 mL塑料离心管中,1 000 r/min离心5 min。取上清液并转移至GC小瓶中待测。
1.3脂肪酸测定
1.3.1仪器色谱仪:日本岛津公司GC2010型气相色谱仪。
1.3.2色谱条件使用RTX-wax型毛细管柱,长度30 m,内径0.25 mm,膜厚0.25 mu;m,温度上限250 ℃。升温程序设置为:120 ℃ 保持1 min,经10 ℃/min到190 ℃,再经2 ℃/min升至236 ℃,平衡2 min。汽化室温度260 ℃,检测器温度260 ℃,分流比15∶1,使用FID检测器,载气为氢气,进样体积为1 mu;L。
1.3.3选用的脂肪酸标记物
细菌特征脂肪酸”“18∶1(n-7);奇数碳/支链脂肪酸(odd amp; br FAs)[14]
硅藻特征脂肪酸”“16∶1(n-7)/16∶0;EPA[14]
原生动物特征脂肪酸”“DHA[14]
褐藻特征脂肪酸”“20∶4(n-6)[14]
1.4数据分析
本实验结果中,数据以平均值plusmn;标准差(meanplusmn;SD)表示。采用SPSS13.0 软件进行方差分析比较细菌特征脂肪酸、硅藻特征脂肪酸、原生动物特征脂肪酸及褐藻特征脂肪酸在不同季节之间的差异显著性,并用Tukey检验法进行多重比较,以P<0.05作为方差分析的显著水平[15-16]。
2结果
2.1悬浮颗粒物的脂肪酸组成的季节变化
GF/F膜样品中饱和脂肪酸(SFA)比例最高,主要为14∶0,16∶0,18∶0;单不饱和脂肪酸(MUFA)主要为16∶1(n-7)、18∶1(n-7)和18∶1(n-9);多不饱和脂肪酸(PUFA)主要为20∶4(n-
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