花粉管通道法转Bar基因胡麻后代分子检测.docVIP

花粉管通道法转Bar基因胡麻后代分子检测 苏文杰 （ 通渭县鸡川镇政府，甘肃 定西 743300 ） 摘 要：以花粉管通道法转Bar基因胡麻T1代胡麻为研究对象，用CTAB法提取DNA，经PCR分别扩增外源基因Bar基因的片段，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测分析，筛选Bar基因成功整合到基因组的单株，结果在114个T1系亚麻植株中检测出5株含有Bar基因的阳性亚麻植株，转化率为4.4%。探讨了花粉管通道法转Bar基因在亚麻中的应用前景。 关键词：花粉管通道法；转基因；胡麻；PCR检测 文章编号： 1005-2690（2017）03-0117-02中图分类号： S512.1文献标志码： B 1 前言 油用亚麻，又名胡麻，拉丁学名Linum usitatissimum，属于亚麻科亚麻属普通亚麻的一个变种，是一年生或多年生草本植物。油用亚麻是我国五大油料作物之一，主要分布在甘肃、内蒙古、山西、宁夏、河北、新疆及青海等省区。 利用转基因技术育种可以打破物种间的遗传障碍，实现优良目的基因的定向转移，同时具有后代易于稳定、育种周期短等优点，为作物育种和品质改良提供了新的途径。已报道亚麻遗传转化主要采用基因枪导入法和农杆菌侵染法，但这两种方法都需要经历组织培养的过程，具有实验设备配备要求高、操作复杂、周期长、成本高等缺点。花粉管通道法是利用植物授粉后形成的天然花粉通道，经珠心通道，将外源DNA携入胚囊，从而转化早期胚胎细胞的方法。它避免了繁琐的组织培养过程，操作简单、成本低廉，可直接用于常规育种。自花粉管通道法问世以来，已在水稻等多种植物的遗传转化中取得成功，但应用在油用亚麻的遗传转化尚未见报道[1]。 Bar基因能使植物抵抗如草丁膦等以PPT为活性成分的除草剂，具有PPT活性的除草剂具有输导型灭生性，杀草谱广，对植物的地上部分和地下部分均有枯杀作用，而且在土壤中易被代谢分解，残留期短，半衰期只有2~3 d。目前，Bar基因已导入水稻、玉米、小麦、大麦、烟草、马铃薯、番茄、高粱、燕麦、甘蔗、番术瓜、菜豆、豌豆、棉花等作物[2]。本论文以花粉管通道法导入Bar基因的T1代胡麻材料为研究对象，通过PCR分子检测手段筛选Bar基因成功整合到基因组的单株，并统计分析转化效率，为开展胡麻转基因育种后续研究奠定基础。 2 材料与方法 2.1 材料 2.1.1 植物材料 试验用花粉管通道法转Bar基因胡麻T0代由甘肃省农业科学院作物研究所胡麻课题组提供，播种后分单株取样检测。 2.1.2 主要试剂 Premix Taq DNA 聚合酶、dNTP、DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司，PCR引物由Invitrogen公司合成。 2.1.3 主要仪器 台式冷冻离心机、基因扩增仪、凝胶成像仪、电泳仪及移液枪。 2.1.4 主要缓冲液配方 CTAB提取缓冲液：100 mmol/L Tris-HCl (pH值8.0)，20 mmol/L EDTA (pH值8.0)，1.5 mol/L NaCl, 2% CTAB (W/V)，4% PVP40 (W/V)和2% 巯基乙醇 (V/V)，PVP和巯基乙醇使用前加入[3]。TE：10 mmol/L Tris-HCl （pH值8.0），1 mmol/L EDTA。6琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝 (W/V)，40%蔗糖 (W/V)。1TAE电泳缓冲液：40 mmol/L Tris-乙酸，1 mmol/L EDTA。 2.2 方法 2.2.1 CTAB法提取DNA 取样：摘取T1代114株胡麻的幼嫩组织，然后分管冷藏。 2.2.2 PCR扩增 以含有由CaMV35S 启动子、Bar基因和NOS 终止子组成的表达框的质粒pG4A作为PCR 检测的阳性对照，未进行转基因操作的胡麻植株为阴性对照，水做空白对照，用Bar基因引物进行PCR扩增。 反应体系如下： Premix Taq Mix 6.25 mu;L Bar-F 1.0 mu;L Bar-R 1.0 mu;L DNA 1.0 mu;L ddH2O 3.25 mu;L 总体积 12.5 mu;L PCR循环参数：94℃预变性 3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，72℃后延伸5 min，经32个循环后10℃保存。 2.2.3 琼脂糖凝胶电泳检测 1.5%琼脂糖电泳点样总量为6 mu;L体系，加样顺序为1 mu;L溴酚兰+5 mu;L扩增样品。 3 结果与分析 3.1 结果 3.1.1 PCR 阳性植株的鉴定 为了验证Bar 基因的导入与否，将T1代114株胡麻的幼嫩组织摘取分管冷藏，以阳性植株为对照进行PCR分析。从中提取DNA 进行Bar 基因的扩增，其结果如图1所示。 3.1.2 花粉管通道法转化率分析 如表1