香烟烟气溶液和砷联合作用对氧化应激和凋亡影响与其机制的的研究.pdfVIP

流烟气，2个串联的大包氏管各装有5ml PBS(pH=7．2)作为吸收液，一端 连接香烟，另一端连接注射器，2s内抽吸35ml，间歇58s后再吸，共吸烟1 支，制成O．1支／“的香烟烟气溶液。 3．细胞染毒 按照2×2析因设计，分别给予4组细胞不同终浓度的CSS和亚砷酸 曼：／ml，亚砷酸钠20／．mol／L)，CSS单独作用组(CSS8x10。支／ml，亚砷酸钠 x 0Hmol／L)，CSS和亚砷酸钠联合作用组(CSS810。支／ml，亚砷酸钠 20ixmol／L)。以RPMI1640为培养基，37qC、5％CO：培养2h。 4．细胞内ROS检测 细胞染毒后，用PBS洗涤2次，以2．77一二乙酰二氯荧光素为荧光探针 用流式细胞仪检测细胞内ROS的相对含量。 5．细胞内丙二醛测定 细胞染毒后，用PBS洗涤2次，冰浴中超声破碎细胞，离心后取上清， 硫代巴比妥酸荧光法测定丙二醛。同时用考马斯亮兰G250测定蛋白浓 度，用以校正细胞内丙二醛的含量。 6．彗星试验 染毒后收集细胞，PBS洗涤2次，制备三明治细胞夹层，裂解、解旋后水 平电泳槽中电泳。中和、染色后，NIKON荧光显微镜下观察，目镜测微尺盲 法测定细胞头长及全长，计算尾长，每张片子随机测量100个细胞。 7．Alamar Blue还原率的检测 收集染毒后的细胞，RPMI1640洗涤两次后重悬细胞，加入Alamar 别于540nm和620nm测定吸光度，计算还原率。 8．细胞凋亡的检测 参照试剂盒说明书进行：细胞染毒后用冷PBS洗两次，将细胞重悬子 buffer中，分别加入AnnexinV—FITC和PI染液，用流式细胞仪检测 binding 10000个细胞，用CellQuest软件分析计数细胞散点图各象限细胞数。 9．Bcl一2、Bax、IKBct及核内N以蛋白表达的检测 免疫印迹法(Westernblot)检测上述基因的蛋白表达情况：收集细胞、 裂解细胞后，提取总蛋白。核蛋白提取按照试剂盒说明书进行，提取后置于 一8012保存。调整总蛋白或核蛋白浓度一致，进行蛋白电泳。蛋白电泳后， ．2． 将蛋白转印到PVDF膜上，封闭后分别加入适当比例稀释的一抗杂交，然后 加入各自相应的二抗再次杂交。化学发光反应后曝光、显影j定影，扫描并 用ImageJ成像分析系统定量分析。 10．核因子KB与DNA结合水平的检测 采用凝胶迁移率变动分析(EMSA)检测核因子KB与DNA结合水平。 染毒后离心收集细胞，提取核蛋白，调整蛋白浓度一致，核蛋白置于一80％ 保存。将DNA结合反应液和核蛋白孵育后，加入用1—32P标记过的NF— KB寡核苷酸再次孵育，上样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，干胶后放射自显 影，显影定影成像。扫描后用ImageJ成像分析系统定量分析。 11．统计分析 比较各组之间的统计学差异，所有实验结果均来自3个以上平行样品或3 次以上重复实验，以P0．05表示统计学差异显著。因为实验分组是根据 2X2析因设计进行的，所以可以应用析因设计的方差分析对是否存在交互 作用进行判定，并进而判定交互作用是否为协同作用。． 实验结果 1．细胞内ROS含量 CSS和亚砷酸钠单独作用或者联合作用都能够使细胞内的ROS含量 组CSS单独作用组亚砷酸钠单独作用组对照组。 2．细胞内丙二醛含量 CSS和亚砷酸钠单独作用或者联合作用都能够使细胞内的丙二醛含量 升高(P0．05)，细胞内丙二醛含量的变化规律为：CSS和亚砷酸钠联合作 用组CSS单独作用组亚砷酸钠单独作用组对照组。 3．彗星试验结果 CSS和亚砷酸钠单独作用或者联合作用都能够使淋巴细胞DNA发生 迁移，彗星尾长与对照组相比均有显著差异(P0．05)。彗星尾长的变化 规律为：CSS和亚砷酸钠联合作用组CSS单独作用组亚砷酸钠单独作 用组对照组。 4。细胞的AlamarBlue还原率 ·3． CSS单独作用组、亚砷酸钠单独作用组、CSS和亚砷