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采用微卫星DNA标记分析皖南中蜂小群保种效果 　摘要：利用筛选后的12对荧光标记微卫星引物分析皖南中蜂野生群与皖南中蜂保种场保种群，探讨小群保种效果。共检测确定60个个体基因型，通过计算2 个群体的优势等位基因频率（Pi）、期望杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、群体内近交系数（Fis）分析了皖南中蜂群体内和群体间的遗传变异，采用配对试验均数差异t检验，比较了保种群体与野生群体的遗传差异。结果表明：保种群体与野生群体间的Pi 无显著性差异（P=0.440gt;0.05）；He略高于野生群体，差异均不显著（P=0.122），PIC 显著高于野生群体（P=0.047gt;0.05）；Fis显著高于野生群体（P=0.019lt;0.05）。结果说明，皖南中蜂采用小群保种效果良好。　　关键词：皖南中蜂；微卫星DNA；遗传多样性；保种效果　　中图分类号： S892文献标志码： A文章编号：1002-1302（2016）05-0062-03　　皖南中蜂是中华蜜蜂的重要组成，皖南中蜂具有适应性强、嗅觉灵敏、善于利用零星蜜粉源、抗病虫害、群势强、产量高等优良性状[1]。皖南中蜂已被农业部和安徽省列入第一批”地方畜禽保护品种名录”。但是长期以来，由于保种经费不足，加上西方蜜蜂的大量饲养，皖南中蜂群数锐减[2]。近几年安徽中锋开始实行小群保种。　　微卫星是目前普遍使用的分子遗传标记方法，具有多态性好、共显性、易于鉴定、检测重复性好以及基因组中分布广泛等优点。联合国粮农组织（FAO）在其持续发展和管理动物遗传资源的战略计划中，推荐将微卫星标记作为优先考虑的分析工具[2-3]。近几年来微卫星标记已广泛应用于我国各地蜜蜂种质资源分析，但是目前普遍采用聚丙烯酰胺电泳加放射显影或银染的方法，不仅费时费力效率低，而且误差较大[4-6]。本研究利用筛选后的12对荧光标记微卫星引物，对保种场与野生种群遗传多样性进行比较分析，旨在初步评价小群保种的效果，继而探讨小群保种的可能性。　　1材料和方法　　1.1试验材料　　本研究所用皖南中蜂为皖南地区保种场群体和原产地野生群体，各随机选取30群，每群随机采集成年工蜂10只，用无水乙醇溶液浸泡保存。　　1.2试验方法　　1.2.1基因组DNA提取基因组DNA提取参照吉挺等所建立的方法[7]，提取的基因组DNA用微量紫外可见分光光度计（NanoDrop ND-1000）测定含量与纯度，-20 ℃保存备用。　　1.2.2常规引物的筛选根据课题组成员对中华蜜蜂转录组测序结果[8]所获得的3 000多个微卫星位点进行筛选，选择的原则为等位基因数目多，具有高度多态性，结合GenBank和相应文献提供的微卫星引物对所选54对引物进行优化，进一步筛选出30对扩增效果较好的微卫星引物。引物均由生工（上海）生物工程服务有限公司（Sangon）提供。　　1.2.3PCR反应体系与产物扩增由于PCR反应中影响因素较多，试验分别设计了以DNA模板浓度、Mg2+浓度、Taq酶用量、退火温度为因素的梯度试验，最终确定PCR的反应体系。PCR反应体系：10times;buffer 2.0 mu;L，25 mmol/L MgCl2 1.0 mu;L，10 mmol/L dNTPs 0.5 mu;L，10 pmol/mu;L 上游引物 1.0 mu;L，10 pmol/mu;L下游引物1.0 mu;L，5 U/mu;L Taq DNA聚合酶0.2 mu;L，100 ng/mu;L DNA模板 1.0 mu;L，超纯水 13.3 mu;L。PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性50 s，（59～62） ℃（因不同引物而异）退火50 s，72 ℃延伸 50 s，共30个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存（Eppendorf，Mastercycler pro S）。　　1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳检测和硝酸银染色配制3%琼脂糖凝胶，点样6 mu;L，120 V电泳20 min，检查产物的有无。如有产物，配制8%聚丙烯酰胺凝胶80 mL体系，100 V预电泳5 min，点样10 mu;L，120 V电泳3 h。进行硝酸银染色，直至出现清晰的等位基因条带。　　1.2.5荧光引物的筛选和组合根据聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，尽量选择不同染色体上的引物进行标记，淘汰掉无法扩增以及无多态性的引物，最终选出相对较理想的12对多态性较丰富的微卫星引物（表1）。每对引物的上游 5prime; 端分别用荧光染料FAM（蓝色）、HEX（绿色）、TAMRA（黄色）进行标记，获得的荧光标记引物避光保存。按照微卫星引物的碱基长度进行组合，为了区分得精确一些，组合的引物长度至少相差20 bp，获得的5个荧光标记微卫星引物组合信息见表1。　　1.2.6荧光PCR产物