高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性结合肽的筛选和其生物学功能.pdfVIP

博}。论文 中文摘要 高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性结合肽 的筛选及其生物学功能 中文摘要 肝细胞癌(简称肝癌)是最常见的恶性肿瘤之一，位居全球恶性肿瘤发病率 的第6位、死因的第3位，在我国已经成为恶性肿瘤第2位的死因。尽管近几十 年以来在肝癌诊治和基础研究方面均取得了长足的进步，但总体而言，肝癌的预 后并没有得到显著的改善，5年生存率仅为5％左右。手术治疗仍是目前肝癌最有 效的方法，但远期疗效欠满意，肝癌根治性切除后5年复发率高达60～70％。因 此，术后转移复发已成为阻碍肝癌病人长期生存的关键，临床上迫切需要探索肝 癌转移复发的分子机制、设计干预治疗的新方法。 肝癌的转移复发是多基因参与、多阶段发展的过程，与癌细胞的侵袭性密切 相关，而癌细胞粘附、侵袭和运动等侵袭性生物学行为均需要细胞表面分子参与。 噬菌体随机肽库技术是筛选肿瘤细胞特异性结合肽的强有力、高通量的新技术， 可在靶分子未知的情况下筛选完整的细胞，适用于筛选复杂的经常改变细胞表面 的肿瘤细胞。针对肿瘤细胞的靶分子，在体外已成功筛选到不同肿瘤细胞如肺癌 细胞、前列腺癌细胞和鼻咽癌细胞等特异性结合肽，这些特异性结合肽在抗肿瘤 转移侵袭、肿瘤的诊断、靶向治疗以及进一步寻找肿瘤细胞表面的受体等方面可 能有潜在的临床应用价值。我所在国际上最早建立了具有遗传背景相似、转移潜 能递增的人肝癌细胞模型系统，寻找与肝癌转移相关的染色体、基因和蛋白质以 及探索干预治疗的新方法。本课题以不同转移潜能肝癌细胞表面的天然受体作为 筛选分子，采用“体外快速差减筛选(BRASIL)”噬菌体随机肽库技术，筛选高 转移潜能肝癌细胞表面分子特异性结合肽，探索其可能的生物学功能，为进一步 研究肝癌转移复发的分子机制以及设计干预治疗的靶点提供新思路。 1．高转移潜能人肝癌细胞表面分子结合肽的差减筛选 本研究的目的是利用遗传背景相似而转移潜能递增的人肝癌细胞模型系统， 以低转移潜能肝癌细胞株MHCC97L(原位接种5周后肺转移率为40％，皮下接种 未见肺转移)和高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3(原位接种5周后肺转移率为100 ％，皮下接种5周后肺转移率达100％)表面的天然受体作为差减筛选分子，采 用“体外快速差减筛选(BRASIL)”噬菌体随机肽库技术，以期筛选出高转移潜 博士论文 中文摘要 能肝癌细胞表面特异性结合肽。 为使筛选到的特异性结合肽具有代表性，我们采取差减筛选策略，先将噬菌 体肽库与MHCC97L共育，这样得到的新噬菌体肽库就消除了与MHCC97L细胞表面 结合的非特异性噬菌体，然后再筛选与HCCLM3细胞表面结合的噬菌体。由于 MHCC97L和HCCLM3具有相似的遗传背景，从而消除了不同样本由于遗传背景不 同而固有的性状差异，将混杂因素减少到最低。研究显示：经过3轮连续差减筛 选，回收率从3．90×10弓增加到1．15×10～，阳性噬菌体克隆得到有效的富集； 随机挑选48个噬菌体克隆进行DNA序列分析，获得11种肽序列，其中展示 体克隆的77％(37／48)。噬菌体体外结合实验显示：所获得的11种噬菌体克隆 与HCCLM3细胞表面的结合效率明显高于对照空白噬菌体(3．3～27．8倍；平均 倍。将AwYPLPP序列与蛋白质序列数据库(Blast)进行同源序列搜索，结果显 示所得到的蛋白质主要为细胞外或细胞表面蛋白、肿瘤特异性抗原及前体、底物 蛋白等，如可能与肿瘤细胞侵袭转移以及肿瘤血管生成相关的细胞外基质蛋白一1 (ECMl)，同源性为71％。 上述结果表明，采用BRAS]L噬菌体随机肽库技术和差减筛选策略，获得了 11种与高转移潜能人肝癌细胞表面分子的结合肽，其中为首的结合肽为 AwYPI．PP。 2．高转移潜能人肝癌细胞表面分子特异性结合肷的鉴定 本部分的研究目的采用噬菌体体外结合实验、流式细胞仪、抗噬菌体免疫细 胞化学染色、免疫荧光染色和激光扫描共聚焦显微镜技术以及噬菌体结合抑制实 验，利用具有不同转移潜能的人肝癌细胞株，对高转移潜能人肝癌细胞表面结合 肽(AWYPLPP肽)的特异性进行鉴定。 本课题的初衷是筛选高转移潜能人肝癌细胞特异性结合肽，尽管AwYPLP