人外周血干细胞向肝细胞转化的探究.pdfVIP

人外周血干细胞向肝细胞转化的研究 硕士生姓名： 杨 芳 专旨导教师： 赵钢教授 指导小组： 刘 晶主任 专业名称： 内科学 摘要 病毒性肝炎，酒精性肝病的发生率越来越高，可能出现的肝硬化及肝硬化的 一系列并发症随之而来，不仅对健康造成严重影响，而且由于其慢性发展，导致 治疗的长期性也给患者带来很大的不便和经济压力。常规的内科治疗只能改善临 床症状，不能逆转由于肝细胞损伤导致的肝功能减退，目前只有原位肝移植能解 决根本问题，但是这个治疗方案带来了一系列问题和限制。我国是一个乙肝大国， 尤其是供体缺乏，费用昂贵令很多人望而却步，所以，寻求一种替代治疗迫在眉 睫，成体干细胞为治疗终末期肝病提供了一个有希望的方法。’ ．近年来，再生领域的干细胞研究取得了巨大进展，国内外大量研究表明，成 体干细胞具有自我更新和分化的潜力，分化为成熟的细胞以取代由于失去正常组 织转化而不断丢失的成熟细胞。假定肝脏干细胞存在于骨髓中首先是由Petersen 提出的，他提出在致死剂量照射的小鼠移植骨髓后发现小鼠的肝脏分化有肝脏干 细胞(卵原细胞)和成熟肝脏细胞。有研究证实骨髓来源的干细胞可以在体内和 体外分化为肝样细胞，目前还不清楚这些标记染色阳性的肝样细胞是否具有肝细 胞的功能特征，以及向肝细胞分化的细胞是否还可以分化为中胚层细胞，如造血 Scal+Lil卜的细胞分化为肝 细胞等。Lagasse表明在小鼠骨髓表达cKit+Thyllow 细胞，不仅有肝细胞表型，还具有肝细胞的功能。 这是干细胞用于肝病治疗的一 个历史性的开端，为终末期肝病，肝脏遗传代谢性疾病的治疗带来新的希望。 目的 1．本研究证实G．CSF动员肝硬化病人的外周血CD34+的比例是否可以增加。 2．分离、纯化的PBMC在体外增殖，在HGF、FGF-4的诱导下是否可以分化成肝 样细胞。通过倒置相差显微镜观察细胞形态变化，免疫荧光染色，Real．timePCR 分析诱导的肝样细胞是否在具有肝细胞的形态同时能表达肝样细胞的表型，包括 白蛋白，甲胎蛋白，细胞角蛋白18，还具有肝细胞的代谢功能如表达CYP等。3． 计算外周血单个核细胞的体外分化效率，是否能为移植细胞的数量提供理论依据。 方法 1．G．CSF动员肝硬化病人的外周血，经血细胞分离机分离后，经流式细胞仪 检测外周血单个核细胞中CD34阳性细胞的数量，并经Ficoll分离液分离提纯后体 外培养。2．用M．CSF、IL．3、m巯基乙醇培养基培养六天，在倒置相差显微镜下 观察细胞的形态，数量，并在增殖六天后用肝细胞生长因子(HGF)和成纤维细 胞生长因子．4(FGF-4)进行诱导，在诱导的0天，7天，14天，分别在倒置相差显 微镜下观察细胞数量，形态的变化，并做免疫荧光观察细胞是否表达白蛋白 测CYP3A、ALB的表达。3．数据用均数士标准差表示，采用SPSSl6．0统计软件， 用统计学进行分析。 结果 1．G．CSF动员后肝硬化病人外周血单核细胞中CD34阳性细胞比例增加，从 0．107％到0．401％。2．分离后的外周血单个核细胞在含有10％胎牛血清的1640培养 置相差显微镜下观察诱导7天后部分细胞形态上发生变化，呈多边形，不规则形 等多种形态。14天后形态学改变较7天增加。经过免疫荧光检测和PCR检测可以 表达肝样细胞的标记物ALB、AFP、CKl8。荧光显微镜下，分别计算诱导7天和 14天的5个高倍视野的细胞数，表达ALB的细胞数，经分析P0．001具有统计学 意义。计算出转化效率得出ALB、CKl8的表达是随着时间成正比的。经PCR分 计学意义。3．未诱导的对照组则呈成纤维样细胞生长，不能表达AFP、CKl8但是 有ALB弱阳性。 结论 1．G．CSF动员可以增加外周血CD34细胞数。 2．体外诱导培养干细胞可以转化为肝细胞。 3．干细胞向肝细胞分化的比例与时间成正比。 4．移植的单个核细胞有近18％可能转化为肝细胞。 5．体外未诱导的干细胞不能转化为肝细胞。本研究证实了源自动员后的肝硬 化病人外周血单个核细胞不仅在体外能诱导分化成肝样细胞而且还具有肝细胞的 功能