不同浓度过氧化脲对牙龈上皮细胞生长影响实验探究.docVIP

不同浓度过氧化脲对牙龈上皮细胞生长影响实验探究[摘要]目的：评价不同浓度过氧化脲对体外培养的人牙龈上皮细胞生长的影响，获得不同浓度过氧化脲引起人牙龈上皮细胞凋亡的时间范围。方法：体外培养人牙龈上皮细胞并进行鉴定，采用含10%及20%过氧化脲的EpiLife上皮细胞专用无血清培养基进行培养，选取不同时间段计算细胞死亡率。结果：体外培养的人牙龈上皮细胞为多边形并呈铺路石状外观，角蛋白染色阳性，含10%过氧化脲培养基进行培养90s后细胞大量死亡，含20%过氧化脲培养基进行培养60s后细胞大量死亡。结论：过氧化脲对体外培养的人牙龈上皮细胞具有较强的细胞毒性，临床常用过氧化脲污染牙龈时间不能超过1min。 [关键词]过氧化脲；牙龈上皮细胞；细胞凋亡 [中图分类号]R783.1 Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）08-1337-03 随着人们对美的不断追求，牙齿美容越来越被人们所重视，牙齿漂白是牙齿美容的一部分，它是根据氧化置换的原理，将牙齿内的色素置换出来，以达到牙齿美白的目的。过氧化脲是常用的牙齿漂白剂之一，随着临床牙齿漂白应用的增多以及家庭漂白的普及，过氧化脲的安全性越来越受到重视[1-2]。 在牙齿漂白的临床操作过程中，与牙齿位置最近的牙龈是最容易受到氧化剂损伤的组织[3]，本研究以体外培养的人牙龈上皮细胞为研究对象，研究不同作用时间下过氧化脲对人牙龈上皮细胞的损伤，为临床过氧化脲的安全应用提供理论依据。 1 材料和方法 1.1 材料：DMEM培养基（Sigma 美国）；胎牛血清（FCS Gibco，美国）；EpiLife角化上皮细胞专用培养基（Cascade Biologics，USA）；胰蛋白酶（Sigma 美国）；兔抗人角蛋白多克隆抗体（MAXIM-BIOTECH，美国）；鼠抗兔IgG（MAXIM-BIOTECH，美国）；SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 选取临床冠延长术患者，签署知情同意书，切取健康牙龈组织，置入含15%胎牛血清的DMEM培养基中。实验室中修剪所获得的牙龈组织，剪除纤维结缔组织，用含100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的D-Hank’s液反复清洗，浸泡20min，然后剪成约0.5mm3的组织块，均匀铺于培养瓶底，5%CO2培养箱中倒置2h，然后加入15%胎牛血清的DMEM培养基进行常规细胞培养，3天后观察有上皮细胞自组织块边缘爬出并生长，继续培养7天后换用EpiLife上皮细胞专用无血清培养基进行培养，每2天更换培养基，待细胞生长至约瓶底的70%～80%时进行传代继续培养。 1.2.2 细胞爬片、鉴定：在培养皿中置入消毒的盖玻片，将传代培养的细胞消化后接种于消毒的盖玻片表面，静置24h后加入培养液，放入二氧化碳培养箱中培养。在培养后第10天，取出生长有上皮细胞的盖玻片，PBS液冲洗干燥制备原代培养的细胞爬片。角蛋白抗体染色采用即用型SABC免疫组化染色试剂盒（博士德公司），一抗为1∶500兔抗人角蛋白多克隆抗体，二抗为生物素标记的鼠抗兔IgG，第2层为酶标生物素-卵白素复合物，DAB显色，中性树胶封片。PBS作空白对照，同时设立成纤维细胞组为阴性对照组。 2 结果 2.1 细胞培养及鉴定结果：组织块贴壁后，第三天开始有上皮细胞从组织块边缘爬出，并以组织块为中心向四周生长，细胞呈多边形，紧密排列，呈铺路石状外观。细胞核大而圆或者卵圆形，有多个核仁，胞浆丰满，细胞分布均匀，大小一致。培养至7～10天时改用EpiLife上皮细胞专用无血清培养基进行培养后，细胞形态没有明显改变，但细胞体积有所减小，排列稍松散。待到细胞进行传代培养后，细胞贴壁后分布均匀，形态以多边形为主出现多样化。细胞来源鉴定：细胞免疫组化染色显示胞浆内呈棕黄丝网状，表明角蛋白阳性。 3 讨论 过氧化脲（carbamide peroxide，CP）又称过碳酰胺、过氧化氢尿素、过氧化碳酰胺，是尿素和过氧化氢所形成的加合物，兼有尿素和过氧化氢的特性，尿素的氨基既能中和过氧化氢的酸性，又克服了过氧化氢难以储存和运输的缺点。过氧化脲理论活性氧含量为17.0%，同其它的几种过氧化物相比，过氧化脲具有活性氧值高，水溶液pH值低，稳定性好，溶解度大，释氧速度慢，作用时间长，用后无残余毒性，对皮肤刺激性、破坏性小等优点，因此，临床上过氧化脲是最常用的漂白剂之一[4]。早在20世纪60年代末，有国外学者就将10%的过氧化脲放置于为患者专门制作的托盘中，这样患者就可以在家中自行漂白。20世纪90年代初，有学者报道了活髓牙夜间漂白技术，因其安全、有效、方便而深受医患双方的青睐[5]。 一般来讲1%～10%的CP用于家庭漂白