抗vWF单克隆抗体SZ125的抗原表位的精确氨基酸定位探究.pdfVIP

抗vWF 单克隆抗体SZ125 的抗原表位的精确氨基酸定位研究 中文摘要 抗vWF 单克隆抗体SZ125 的抗原表位的 精确氨基酸定位研究 中文摘要 研究背景： 血栓性疾病是严重威胁人类健康的疾病之一，也是引起人类死亡的最常见疾病。 血小板黏附到受损的血管壁上是血栓形成的第一步，在这一过程中，血管性血友病因 子(von willebrand factor, vWF)起关键作用，它在血小板与内皮下基质(主要是各型胶原 纤维) 的相互黏附中起着桥梁作用，介导血小板粘附于血管损伤部位暴露的内皮下胶 [1,2] 原 。vWF是一种由多个功能结构域组成的多聚糖蛋白，它一方面通过自身的A1 区 [3-5] 与血小板膜受体GPIb-IX-V复合物结合，另一方面通过其A3 区与胶原结合 。在正常 情况下，vWF处于静息状态，并不与血小板发生反应。然而，在病理条件下如在动脉 粥样斑块变狭窄部位，vWF通过其A3 区与暴露的内皮下胶原纤维结合，在血流剪切 力的作用下，vWF随之发生空间构象的变化，使其可以与血小板膜表面糖蛋白GPIbα 结合，进而使血小板发生聚集，最终导致血栓形成。因此，vWF-A3 区与胶原的结合 [2] 是启动血小板粘附、聚集并进而导致血栓形成的首要环节 。 我室曾报道了一株特异性结合vWF-A3 区的单克隆抗体(mAb)-SZ125，这株mAb 不仅可以有效阻断静止和流体状态下vWF与Ⅲ型胶原的相互作用，而且能抑制瑞斯托 [6] 霉素或博妥霉素诱导的血小板聚集 。该抗体是针对胶原-vWF-GPIb轴来阻止血小板 的早期粘附和活化，具有更早、更好的抗栓活性，并减少出血危险性，具有更为广阔 的应用前景。为了更深入地了解vWF-A区结构与功能间的关系，有必要对SZ125所结 合的具体氨基酸位点做精确的分析。 抗原表位的鉴定对于研究整个免疫过程以及抗原本身结构与功能的关系具有重 要的意义，用于定位mAb 的抗原表位的方法有很多，最常用的就是根据抗原氨基酸 序列制备合成肽法。随着电离质谱技术的迅速发展, 特别是基质辅助激光解吸电离飞 行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, I 中文摘要 抗vWF 单克隆抗体SZ125 的抗原表位的精确氨基酸定位研究 MALDI-TOF-MS)技术的出现, 使得抗原表位研究有了更进一步的发展。与传统方法 相比,质谱分析可直接分析抗原表位，具有耗样量少、分析速度快、灵敏度和准确度 高等优点。免疫亲和质谱是免疫亲和技术和现代质谱技术的结合, 是测定抗原表位的 有效方法。这种方法利用特异的蛋白酶将不受保护的抗原水解，只剩下与抗体连接受 保护而未发生水解的肽段，然后利用MALDI-MS 对该肽段进行研究。因此，应用免 疫亲和质谱技术，结合合成肽法和氨基酸定点诱变技术，可以对mAb SZ125 所结合 的具体氨基酸位点进行精确定位。 目 的： 本研究旨在应用免疫亲和分离与质谱分析技术，结合合成肽法和氨基酸定点诱变 技术，确定抗vWF单克隆抗体SZ125的精确氨基酸抗原表位，从而为研究探讨单抗 SZ125的抗栓机制提供理论依据，为下一步研究vWF-A区结构与功能之间的关系以及 将来开发基于单抗SZ125的抗栓药物奠定基础。 方 法： （1）首先制备溴化氰活化的琼脂糖珠，并耦联SZ125；将该SZ125-琼脂糖珠与 重组的vWF-A3 蛋白(rvWF-A3)混合反应后，加入胰蛋白酶酶解rvWF-A3 蛋白，产生 一系列酶解后的抗原肽段，然后用 MALDI-TOF-MS