筛选携带ROK2基因siRNA有效片段的慢病毒载体.pdfVIP

目 录 1 筛选携带 ROCK2 基因 siRNA 有效片段的慢病毒载 体………………………………………………………………2 1.1 中文摘要………………………………………………………3 1.2 英文摘要………………………………………………………5 1.3 前言……………………………………………………………8 1.4 材料与方法……………………………………………………10 1.5 结果……………………………………………………………30 1.6 讨论……………………………………………………………38 1.7 结论……………………………………………………………40 1.8 参考文献………………………………………………………4 1 1.9 英汉缩略词对照表……………………………………………44 2 致谢……………………………………………………………45 3 中医药治疗慢性前列腺炎的分子机制（综述） …………………………………………………………………46 2 筛选携带ROCK2 基因siRNA 有效片段的慢病毒载体 摘要 目的：筛选能够显著抑制自发性高血压大鼠（SHR）阴茎海绵体 平滑肌细胞内 Rho 关联含卷曲螺旋蛋白激酶 2 （Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2，ROCK2）基因表达的携 带 siRNA 的慢病毒载体。方法：1.采用组织块贴壁培养法分离培养 SHR 阴茎海绵体平滑肌细胞。2.靶向大鼠ROCK2 基因设计具有基因特 异性的小干扰 RNA(small interference RNA，siRNA)，构建其短发 夹 RNA(short hairpin RNA, shRNA)重组慢病毒表达载体。①设计 RNAi 靶点序列并合成靶序列的 Oligo DNA，退火形成双链 DNA，与 经Hpa I、XhoI 进行酶切后的GP-Supersilencing Vector 载体连接 产生 shRNA 慢病毒载体。②转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，筛选 阳性菌落、扩增后提取质粒，进行 DNA 测序鉴定。③ GP-Supersilencing Vector 与三种混合包装质粒共转染293T 细胞， 包装产生shRNA 重组慢病毒。 3.随机将5 只SHR 阴茎海绵体平滑肌 4 细胞分为6 组（每组n=5），每组每个样本3×10 个细胞，分别为：A 组（未转染对照组）、B 组（携带慢病毒转染组）、C～F 组 （分别携带 靶向ROCK2 基因的siRNA1～4 号靶点的慢病毒转染组），以MOI=80 转 染SHR 阴茎海绵体平滑肌细胞，转染后48 小时荧光显微镜下观察细 胞GFP 表达情况，并用RT-PCR 检测各组被转染细胞ROCK2 基因mRNA 3 的表达。结果： 1.经酶切及基因测序鉴定证实重组慢病毒载体质粒 构建成功。 2.荧光显微镜下观察各组细胞感染效率均大于 50%。 3.RT-PCR 方法检测转染后各组ROCK2 mRNA 的表达：与A 组相比，B 组ROCK2 基因mRNA 的表达无明显改变 （P ﹥0.05）；C 组、D 组、F 组 SHR 阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2 基因mRNA 的表达较A 组极显著下 降 （P0.01），抑制效率分别达到43.91±8.19℅、47.15±6.64℅、 25.7±6.03℅；E 组SHR 阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK2 基因mRNA 的 表达较A 组显著下降（P0.05），抑制效率为16.81±5.94℅。结论： 1.本研究成功构建了大鼠ROCK2 基因 RNAi 慢病毒载体，为后续的改 善SHR 勃起功能的体内外实验奠定了基础。2.构建的4 种携带ROCK2 基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR 阴茎海绵体平滑肌细胞 内ROCK2 基因的表达，其中有3 种慢病毒载体抑制作用较强。 关键词：SHR 大鼠；