体视学方法在AD研究中及运用-唐勇-2014-10-11.ppt

体视学方法在AD研究中的运用 唐 勇 重庆医科大学基础医学院 特别值得强调的是，在国际上新的体视学方法已与各类特殊染色方法、免疫组织化学方法及分子生物学图像（如原位分子杂交图像）等结合起来，用于对经过基因改造（转基因或基因剔除）的动物模型的定量研究中。因此，体视学方法已成为连接分子生物学和形态学研究、功能研究的桥梁。 平面轮廓面积的计算 三维空间内随机抽样 光学体视框示意图 如上图所示，1平面示聚焦的第一个平面，作为对照平面，向下不断聚焦观察粒子，这样按照体视框的计数原则a粒子不能被计数，在2、3、4平面，b、c、d粒子被计数。 光学分合法的原理 Tg2576转基因AD小鼠： 4月龄组 14只 6月龄组 14只 8月龄组 20只 10月龄组 12只 Morris水迷宫实验 Morris水迷宫测试 大脑白质的体视学定量分析 冰冻切片的免疫组化染色步骤 A. 连续的1mm 大脑切片 B. 在大脑切片上叠加等距测点，根据随机落在白质上的测点抽取组织块,○所示为落在白质上的测点 Morris水迷宫测试 Acknowledgements 6月龄转基因AD小鼠 雄性 20只 雌性 20只 跑步组 雌雄各10只 对照组 雌雄各10只 速度:10m/min；时间: 20min/d,5d/week,为期4个月 标准环境饲养4个月 大脑白质的体视学分析 小鼠麻醉,灌注固定,取出大脑 分离双侧大脑半球，作1mm连续脑片 解剖显微镜下计数并计算白质总体积 随机选取一侧半球 在白质内均匀随机抽取4个组织块,各向同性包埋后再用常规电镜法包埋 从每个组织块随机切取一张超薄切片 随机选择视野拍照(×8000) 体视学计算白质结构内有髓神经纤维总长度、总体积等 结 果 跑步锻炼干预 * 雄性 跑步锻炼干预 雌性 大脑白质的体视学定量分析 白质总体积 雄性 有髓神经纤维总长度 有髓神经纤维总体积 髓鞘总体积 轴突总体积 雄性 白质总体积 雌性 雌性 跑步锻炼对APP/PS1转基因AD小鼠 大脑海马内有髓神经纤维的体视学研究 小鼠麻醉,灌注固定,取出大脑 分离双侧大脑半球，作1mm连续脑片 解剖显微镜下计数并计算海马DG总体积 随机选取一侧半球 在海马DG内均匀随机抽取4个组织块,各向同性包埋后再用常规电镜法包埋 从每个组织块随机切取一张超薄切片 随机选择视野拍照(×8000) 体视学计算海马DG内 有髓神经纤维总长度、总体积等 随机选择视野拍照(×20000) 体视学计算海马DG内有髓神经纤维 髓鞘内、外直径和内、外周长等 小鼠海马DG区边界划分 有髓神经纤维长度 有髓神经纤维体积 有髓神经纤维直径及周长 结 果 海马DG总体积 海马DG内有髓神经纤维总长度 海马DG内有髓神经纤维、髓鞘和轴突体积 海马DG内有髓神经纤维和轴突平均直径 光学分合法 光学分合法就是分合法与光学体视框结合在一起的一种用于研究器官内待测粒子数目的体视学方法。 某一器官内待测粒子的总数目等于运用光学体视框最后计数的粒子数目（∑Q￣）乘以切片抽样分数的倒数（1/ssf）乘以面积抽样分数的倒数（1/asf）乘以高度抽样分数的倒数（1/stsf），即： Tg2576转基因AD小鼠早期行为学、 大脑白质内有髓神经纤维的改变 实验动物： 同窝生野生型小鼠： 4月龄组 15只 6月龄组 15只 8月龄组 15只 10月龄组 15只 模型组 对照组 雄性Tg2576小鼠 标记动物 划分象限，放置平台，确定入水点 设置空间标记物 放入动物，记录寻台时间 SPSS统计分析 第1～6天定位航行实验 第7天空间探索实验 小鼠麻醉,灌注固定,取出大脑 分离双侧大脑半球，作1mm连续脑片 解剖显微镜下计数并计算白质总体积 随机选取一侧半球 在白质内均匀随机抽取4个组织块,各向同性包埋后再用常规电镜法包埋 从每个组织块随机切取一张超薄切片 随机选择视野拍照(×8000) 体视学方法研究神经纤维的长度密度、体积密度等 计算白质结构内有髓神经纤维总长度、总体积 体视学方法 白质总体积 有髓神经纤维总长度 有髓神经纤维体积/髓鞘体积/轴突体积 结 果 4月龄 6月龄 8月龄 10月龄 * 10月龄小鼠白质总体积 有髓神经纤维总长度 有髓神经纤维总体积 髓鞘总体积 轴突总体积 Tg2576转基因AD小鼠 大脑海马结构内有髓神经纤维的改变 小鼠麻醉,灌注固定,取出大脑 分离双侧大脑半球分别测量脑长及脑重 作1mm连续脑片，并在每张脑片枕侧切取一张冰冻切片进行尼氏染色 使用VIS体视学系统计算海马的总体积及CA1区和DG区的体积 随机选取一侧半球 在海马、CA1及DG均匀随机抽取2～3个组织块,各向同性包埋后再用常规电镜法包埋 从每个